發(fā)布時(shí)間：2018-05-07 08:55

  本文選題：垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽 + 飲食抑制��； 參考：《華東師范大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP)是血管活性腸肽(vasoactive intestinal polypeptide, VIP)/促胰液腺素/胰高血糖素/生長激素釋放激素家族的一員,與VIP有68%的同源性。同VIP一樣,PACAP是一種多效性多肽,其生物學(xué)功能涉及機(jī)體9大系統(tǒng),而且對(duì)糖尿病、肥胖、高血壓、哮喘、帕金森等疾病的治療有一定的積極作用。然而,PACAP的體內(nèi)半衰期較短(約5-10min),且目前針對(duì)這一問題的研究較少,并都需要進(jìn)行體外化學(xué)修飾,操作繁瑣、所得衍生物活性受限。因此,本研究對(duì)PACAP的氨基酸序列進(jìn)行改造,在其羧基端末尾添加半胱氨酸,擬使其能與機(jī)體血清白蛋白結(jié)合,抑制可能存在的降解行為,提高體內(nèi)穩(wěn)定性；并用基因工程技術(shù)制備PACAP及其衍生物,降低研究成本；此外,本研究還通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探究了PACAP及其衍生物在抗肥胖、抗腫瘤和降血糖方面的活性。 本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果概述如下： 1) PACAP及其衍生物的克隆、表達(dá)、純化 對(duì)GenPept報(bào)道的PACAP(包括PACAP38和PACAP27)的氨基酸序列進(jìn)行改造,將改造衍生物命名為cPACAP (cPACAP38和cPACAP27);人工合成cPACAP38的堿基序列后,PCR擴(kuò)增PACAP38、PACAP27和cPACAP27的基因序列；為使目的多肽與硫氧還蛋白(Trx)融合表達(dá),采用克隆技術(shù)將目的基因插入表達(dá)載體pET32a(+)中,獲得4種表達(dá)質(zhì)粒后分別轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3),得到4種表達(dá)菌株——BL21-pET32a(+)-PACAP38、BL21-pET32a(+)-cPACAP38、BL21-pET32a(+)-PACAP27、BL21-pET32a(+)-cPACAP27。 表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)融合蛋白,共4種——Trx-PACAP38、Trx-cPACAP38、Trx-PACAP27、Trx-cPACAP27,其表達(dá)量分別為22.1%、24.6%、47.3%、47.7%,可溶性融合蛋白占表達(dá)量的百分比分別為48.7%、54.0%、88.3%、66.6%。 將IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌液超聲破碎后,經(jīng)兩次鎳離子螯合親和層析,得到4種目的多肽——PAC AP38、cPAC AP38、PAC AP27、cPAC AP27,得量分別為1.6mg、1.8mg、9.1mg、5.7mg, ImageJ軟件掃描純度均在95%以上。 2) PACAP及其衍生物的活性測(cè)定與比較 采用小鼠飲食抑制實(shí)驗(yàn),對(duì)基因工程制備的PACAP及其衍生物進(jìn)行活性測(cè)定和比較。結(jié)果表明,不同劑量的4種目的多肽對(duì)小鼠飲食均有抑制作用,而且cPACAP38與cPACAP27的活性明顯比PACAP38與PACAP27強(qiáng),cPACAP38的效果能持續(xù)12h仍有顯著性差異,cPACAP27也能維持12h有統(tǒng)計(jì)意義。表明與天然PACAP相比,衍生物cPACAP的體內(nèi)活性更穩(wěn)定、效果更持久。 3) PACAP及其衍生物生物學(xué)活性探究 長期給藥觀察PACAP38及cPACAP38的抗肥胖效果。連續(xù)10天給小鼠腹腔注射PACAP38和cPACAP38,結(jié)果顯示,小鼠體重、糖耐量及體內(nèi)肥胖相關(guān)指標(biāo)如甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和膽固醇等并沒有明顯變化。 用MTT比色分析法檢測(cè)不同濃度PACAP27和cPACAP27對(duì)人乳腺癌細(xì)胞Bcap37、人肝癌細(xì)胞BEL7404、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y、人肺癌細(xì)胞A549增殖活性的影響,結(jié)果未顯示出調(diào)控作用。 用腹腔糖耐量及降糖藥效法分析PACAP27和cPACAP27對(duì)GLP-1降糖活性的影響。發(fā)現(xiàn),將PACAP27及cPACAP27與GLP-1混合后給小鼠注射,其降糖效果更明顯,給藥劑量為1 Onmol/kg時(shí),混合給藥組的降糖效果能持續(xù)1.5h,是單獨(dú)GLP-1給藥組的3倍,提示PACAP對(duì)GLP-1的降糖活性有輔助作用。 通過以上研究,得到4種基因工程表達(dá)菌株,獲得了體內(nèi)生物學(xué)活性更穩(wěn)定、效果更持久的PACAP衍生物(cPACAP38和cPACAP27),并通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了PACAP對(duì)GLP-1降血糖效果的輔助作用,為PACAP的進(jìn)一步理論和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:As VIP , PACAP is a kind of multipotent polypeptide which has a positive effect on the treatment of diabetes , obesity , hypertension , asthma and Parkinson ' s disease .
PACAP and its derivatives were prepared by genetic engineering technique , and the research cost was reduced .
In addition , the activities of PACAP and its derivatives in anti - obesity , anti - tumor and blood glucose lowering were investigated by animal experiments and cell experiments .


The main contents and results of this study are summarized below :


1 ) Cloning , expression and purification of PACAP and its derivatives


The amino acid sequences of PACAP ( including PACAP 38 and PACAP 27 ) reported by GenPept were modified . The modified derivatives were named cPACAP ( cPACAP 38 and cPACAP27 ) . After the nucleotide sequence of cPACAP38 was synthesized , PACAP 38 , PACAP27 and cPACAP27 were amplified by PCR .
The expression vector pET32a ( + ) was inserted into the expression vector pET32a ( + ) , and the expression vector pET32a ( DE3 ) was transformed into BL21 ( DE3 ) . The expression vector pET32a ( + ) - cPACAP38 , BL21 - pET32a ( + ) - PACAP27 , BL21 - pET32a ( + ) - cPACAP27 were obtained .


The expression of soluble fusion protein was 48.7 % , 54.0 % , 88.3 % and 66.6 % , respectively .


Four kinds of polypeptide _ PAC AP38 , cPAC AP38 , PAC AP27 and cPAC AP27 were obtained after ultrasonic disruption of the bacterial solution induced by IPTG . The yield of PAC AP38 , PAC AP27 , cPAC AP27 was 1.6 mg , 1.8 mg , 9.1 mg , 5.7 mg , respectively , and the scanning purity of ImageJ software was above 95 % .


2 ) Determination and Comparison of the Activity of PACAP and Its Derivatives


The results showed that the activity of cPACAP 38 and cPACAP 27 was significantly higher than that of PACAP 38 and PACAP 27 , and cPACAP 27 could be maintained for 12 h .


3 ) Biological activity of PACAP and its derivatives


PACAP38 and cPACAP38 were injected intraperitoneally for 10 days . The results showed that the indexes such as triglyceride , high density lipoprotein , low density lipoprotein and cholesterol did not change in mice .


The effects of PACAP27 and cPACAP27 on proliferation activity of human breast cancer cell line Bcap37 , human hepatoma cell BEL7404 , human neuroblastomas SH - SY5 and human lung cancer cell A549 were detected by MTT colorimetric assay .


The effects of PACAP 27 and cPACAP27 on GLP - 1 hypoglycemic activity were analyzed by intraperitoneal glucose tolerance and hypoglycemic drugs . It was found that PACAP 27 and cPACAP27 were injected into mice after being mixed with GLP - 1 . The results showed that the hypoglycemic effect of PACAP 27 and cPACAP27 was 1 . 5h , which was 3 times higher than that of GLP - 1 alone , suggesting that PACAP had an auxiliary effect on the hypoglycemic activity of GLP - 1 .


The PACAP derivatives ( cPACAP38 and cPACAP27 ) were obtained in four kinds of gene engineering strains . The results showed that PACAP derivatives ( cPACAP38 and cPACAP27 ) were more stable and more effective in vivo , and the effect of PACAP on GLP - 1 hypoglycemic effect was proved through in vivo experiments , which laid the foundation for further theoretical and application research of PACAP .

【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：1856286