本文選題：ALB1基因 + △alb1��； 參考：《濟(jì)南大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的 探索煙曲霉菌ALB1基因在真菌與角膜粘附中的作用,為闡明真菌與角膜相互作用的分子機(jī)制提供資料。 方法 分別利用煙曲霉菌野生型菌株(B5233)與基因突變株(△alb1)孢子粘附單層角膜上皮細(xì)胞及角膜的體外器官和體內(nèi)動(dòng)物模型,通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞和角膜上粘附孢子的數(shù)量,確定ALB1基因突變對(duì)煙曲霉菌角膜粘附力的影響。 1.比較兩種菌株在單層角膜上皮細(xì)胞的粘附量 將生長(zhǎng)良好的角膜上皮細(xì)胞(HCEC),接種于24孔板,每孔1×10~5個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)6-8小時(shí)細(xì)胞貼壁,后換無(wú)血清培養(yǎng)液過(guò)夜。加真菌孢子懸液,真菌孢子量與細(xì)胞量比例為10:1,37℃、飽和濕度5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育60min,用生理鹽水沖洗三次,孔中加熒光白染色30s,熒光顯微鏡照相。再加細(xì)胞裂解液裂解上皮細(xì)胞,樣品按不同稀釋度均勻涂布于沙氏培養(yǎng)基平板上,37℃培養(yǎng)24h,計(jì)數(shù)形成的菌落。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 2.小鼠眼器官模型觀察兩種菌株粘附量的區(qū)別 Balb/c小鼠5只,經(jīng)處理后取出眼球,置于96孔板內(nèi)。10只眼分為兩組,兩組孔中分別加入B5233與△alb1真菌孢子懸液(濃度1×10~9CFU/ml),置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育30min。取出眼球,用生理鹽水沖洗三次,每組3只眼球檢測(cè)載菌量;另2只眼球中性甲醛固定,石蠟包埋,切片后糖原染色(PAS染色)觀察孢子粘附情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。 3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)比較兩種菌粘附力的區(qū)別 8-10周Balb/c小鼠10只,分為兩組,每組5只。腹腔麻醉,用濾紙片擦拭角膜表面,再將約0.5cm長(zhǎng)的輸液管套在小鼠眼球上,縫線固定。管內(nèi)加0.5%EDTA 20μl,作用1h。移液器吸去EDTA后,兩組分別加入兩種菌株的真菌孢子懸液(濃度1×10~9CFU/mL)10μl,作用1h,去除套管,頸椎脫臼處死小鼠,摘取眼球用生理鹽水洗三次。每組3只眼球用于載菌量檢測(cè),計(jì)數(shù)形成的菌落;另2只眼球用中性甲醛固定,石蠟包埋,糖原染色(PAS染色)觀察孢子粘附。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。 結(jié)果 1.角膜上皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩種菌株粘附量的區(qū)別 1.熒光顯微鏡圖片可見(jiàn)B5233菌株的粘附密度明顯高于△alb1菌株。 2.真菌負(fù)荷檢測(cè),其中B5233菌株組粘附數(shù)量為151635±27330個(gè)/孔(CV=18.0%),△alb1菌株組粘附數(shù)量為63333±15756個(gè)/孔(CV=24.9%), B5233菌株粘附率大于△alb1菌株。且兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 2.眼器官模型檢測(cè)兩種菌株的角膜粘附量區(qū)別 真菌負(fù)荷檢測(cè),兩種菌株粘附量分別為1676±313個(gè)/器官、675±102個(gè)/器官。B5233菌株粘附率大于△alb1菌株,且兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較兩種菌株的角膜粘附量 經(jīng)真菌負(fù)荷檢測(cè),其中B5233菌株組粘附數(shù)量為680±121個(gè)/角膜(CV=17.8%),△alb1菌株組粘附數(shù)量為314±45個(gè)/角膜(CV=14.3%)。B5233菌株粘附率大于△alb1菌株。且兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論 ALB1基因的突變使真菌孢子對(duì)角膜上皮細(xì)胞和在體及體外角膜的粘附力下降。 目的研究小鼠角膜抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的機(jī)制 方法小鼠角膜勻漿液上清和滅活真菌孢子裂解液刺激的人角膜上皮細(xì)胞、人角膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清分別與白色念珠菌共培養(yǎng),每6h測(cè)600nm光密度(OD)值一次,最后根據(jù)各點(diǎn)測(cè)得的OD值繪制真菌的生長(zhǎng)曲線。角膜勻漿液與白色念珠菌共培養(yǎng)2h、4h、6h后用PI染色,激光共聚焦顯微鏡照相,觀察死亡真菌(PI染色陽(yáng)性)比例。 結(jié)果: 1.角膜勻漿液上清對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)曲線的影響 角膜勻漿液上清與白色念珠菌共培養(yǎng)的30小時(shí),實(shí)驗(yàn)組在6h后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的OD值均高于對(duì)照組。 2.HCEC細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)曲線的影響 HCEC細(xì)胞加滅活的菌液刺激后收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清與白色念珠菌共培養(yǎng)。真菌生長(zhǎng)曲線表明HCEC培養(yǎng)上清對(duì)真菌生長(zhǎng)沒(méi)有任何作用。 3.HTK與U937細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)曲線的影響 用滅活的真菌裂解液對(duì)HTK與U937細(xì)胞的共培養(yǎng)體系進(jìn)行刺激,收集的培養(yǎng)上清分別與白色念珠菌共培養(yǎng)30小時(shí),實(shí)驗(yàn)組真菌的生長(zhǎng)曲線也表明對(duì)菌液生長(zhǎng)沒(méi)有任何作用。 4.角膜勻漿液上清對(duì)白色念珠菌存活的影響 角膜勻漿液與白色念珠菌共培養(yǎng)2h、4h、6h后用PI染色,三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未見(jiàn)有角膜裂解液有促進(jìn)或抑制孢子死亡的作用,但在作用4h、6h時(shí),可見(jiàn)角膜裂解液促進(jìn)真菌孢子萌發(fā)出芽。 結(jié)論角膜對(duì)真菌具有天然的防御能力,只有當(dāng)這種天然防御被破壞時(shí)(如角膜上皮結(jié)構(gòu)的完整性被破壞時(shí)),真菌才有可能在角膜上定植,真菌性角膜炎才有可能發(fā)生。
[Abstract]:Purpose

To explore the role of Aspergillus fumigatus ALB1 gene in fungal and corneal adhesion , and to provide information for the molecular mechanism of fungal and corneal interaction .

method

The effect of ALB1 gene mutation on the corneal adhesion of Aspergillus fumigatus was determined by detecting the number of adherent spores on the cells and cornea by using Aspergillus fumigatus wild - type strain ( B5233 ) and mutant strain ( 鈻，

本文編號(hào)：1848273