發(fā)布時間：2018-05-05 00:30

  本文選題：人內皮祖細胞 + 脂聯(lián)素��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2012年碩士論文

【摘要】：目的 內皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)又稱為成血管細胞，不僅參與胚胎時期的血管生成，而且參與出生后的血管新生與內皮損傷修復。糖尿病合并心血管并發(fā)癥患者的EPCs數(shù)量減少，功能減退，能夠導致血管再內皮化及修復過程受損。脂聯(lián)素(adiponectin, APN)是一種脂肪源性血漿蛋白，對心血管具有保護作用。APN具有抗炎和抗動脈粥樣硬化的作用，可促進血管生成；另外，APN還可以通過調節(jié)細胞代謝，來減少心肌缺血再灌注損傷、抑制心肌肥厚性重構。大量研究證明，經(jīng)過APN干預，可使EPCs的數(shù)量增加。然而，APN是否能改善高糖環(huán)境下EPCs的數(shù)量和功能尚未清楚。為此，我們通過實驗給予EPCs不同濃度的葡萄糖干預，觀察葡萄糖對EPCs數(shù)量和功能的影響；在此基礎上，給予不同濃度的APN干預，觀察各濃度APN對高糖損傷后EPCs數(shù)量和功能的影響以明確APN對EPCs的保護作用，并探討其可能的機制，為臨床治療代謝綜合征性心血管疾病提供新的干預靶點和必要的科學理論依據(jù)。 方法 1、EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：采用密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞，經(jīng)含堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內皮生長因子(VEGF)及10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)7d，進行形態(tài)學、流式細胞儀測細胞分子標志物(CD34、CD133和KDR)和激光共聚焦倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞攝取ac-LDL和結合UEA-I鑒定。 2、不同濃度葡萄糖對EPCs的影響：收集培養(yǎng)4d的細胞，給予不同濃度的葡萄糖(5.5、20、25、30、50mmol/l)干預48h，同步化后用MTT比色法檢測EPCs的增殖能力；用Annexin V-FITC法檢測EPCs的凋亡率；用熒光探針(DCFH-DA)檢測法進行細胞活性氧(ROS)水平檢測。 3、APN對高糖環(huán)境下EPCs的影響：將培養(yǎng)4d的EPCs分為7組：其中3組細胞分別給予5.5mmol/l葡萄糖、5.5mmol/l葡萄糖+24.5mmol/l甘露醇、30mmol/l葡萄糖干預96h，其余4組細胞先給予30mmol/l葡萄糖干預48h，然后分別給予：1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml APN干預48h。收集細胞，同步化后檢測EPCs的增殖、遷移、凋亡及ROS水平。 4、統(tǒng)計學處理方法：用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以X|-±s表示，組間資料比較采用ANOVA，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。 結果 1、EPCs培養(yǎng)和鑒定：密度梯度離心法分離出的外周血單個核細胞圓形透亮，培養(yǎng)4d后出現(xiàn)短梭形貼壁細胞，并有典型細胞集落；培養(yǎng)7d，細胞集落增加明顯，梭形細胞增多并呈交叉性生長；用激光共聚焦倒置顯微鏡觀察，細胞攝取DiI-acLDL呈紅色熒光，攝取FITC-UEA-I呈綠色熒光，，攝取DiI-acLDL并結合FITC-UEA-I的細胞呈黃色熒光，流式細胞儀分析結果提示：細胞表達KDR、CD133、CD34，其中KDR、CD133、CD34陽性細胞比例為92.32%、10.7%、23.3%。證實培養(yǎng)的細胞是正在分化的EPCs。 2、不同糖濃度對EPCs的影響：當糖濃度分別為5.5mmol/l、20mmol/l、25mmol/l、30mmol/l、50mmol/l時MTT法測出的A值分別為(0.287±0.031)、(0.252±0.034)、(0.242±0.019)、(0.215±0.024)、(0.208±0.017)，凋亡率分別為(8.495±1.279)%、(12.942±1.177)%、(14.770±1.438)%、(16.393±1.216)%、(17.502±1.259)%，DCF法測出的ROS水平(OD值)分別為(0.361±0.053)、(0.468±0.090)、(0.483±0.053)、(0.518±0.081)、(0.613±0.098)。結果提示，隨著糖濃度的增高，EPCs的增殖能力下降，凋亡、ROS水平增加(P0.01)；其中當糖濃度為30mmol/l與50mmol/l時，兩者相比對EPCs的影響無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 3、APN對高糖損傷后EPCs的影響：對以下7組細胞(5.5mmol/l葡萄糖組、高滲組、30mmol/l高糖組、高糖+1.25μg/mlAPN組、高糖+2.5μg/mlAPN組、高糖+5μg/mlAPN組、高糖+10μg/ml APN組)進行檢測的結果分析后可以看出與正常糖濃度對照組相比，高滲對照組EPCs的增殖、遷移、凋亡和ROS水平無統(tǒng)計學差異(P0.05)，卻顯著高于高糖組，說明高糖對內皮祖細胞的影響是糖濃度造成的，而非滲透壓。在30mmol/l葡萄糖條件下，EPCs的數(shù)量和遷移功能較正常對照組明顯下降，細胞凋亡增多，不同濃度APN干預后能明顯提高高糖損傷后的EPCs的功能(P0.05)，隨著APN濃度的增加，EPCs的增殖與遷移能力增高，凋亡、ROS水平下降(P0.01)。 結論 1、高糖干預可導致EPCs增殖能力下降，細胞凋亡增多； 2、高糖干預后加入APN，EPCs的增殖、遷移能力恢復，細胞凋亡減少，并在一定范圍內，其作用隨濃度的增加而增強； 3、高糖可以引起EPCs的ROS水平升高、功能受損，而APN可以降低高糖引起的ROS水平，保護EPCs的功能；滲透壓對EPCs無影響。
[Abstract]:Purpose

Endothelial progenitor cells ( EPCs ) are also referred to as vascular cells , not only in angiogenesis in the embryonic period but also in the repair of vascular neovascularization and endothelial damage after birth . The number of EPCs in patients with diabetes mellitus complicated with cardiovascular complications is reduced , and the function decreases . It can lead to damage of vascular restenosis and repair . Adironin ( APN ) is a fat - derived plasma protein , which has protective effect on cardiovascular diseases . APN has anti - inflammatory and anti - atherosclerosis effects , and can promote angiogenesis ;
In addition , APN can decrease myocardial ischemia - reperfusion injury and inhibit myocardial hypertrophy remodeling by regulating cell metabolism . However , it is not clear whether APN can improve the quantity and function of EPCs in high - sugar environment . However , it is not clear whether APN can improve the quantity and function of EPCs in high - sugar environment .
The effects of APN on the number and function of EPCs after high glucose damage were observed . The possible mechanism of APN was discussed , and the new intervention targets and necessary scientific theories were provided for the clinical treatment of metabolic syndrome .

method

1 . Isolation , culture and identification of EPCs : Human peripheral blood mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation , cultured for 7 days by M199 medium containing basic fibroblast growth factor ( bFGF ) , vascular endothelial growth factor ( VEGF ) and 10 % fetal bovine serum . The morphological , flow cytometry and laser confocal inverted microscope were used to observe the identification of ac - LDL and UEA - I in cultured cells .

2 . Effects of different concentrations of glucose on EPCs : collecting cultured 4d cells , giving different concentrations of glucose ( 5.5 , 20 , 25 , 30 , 50mmol / l ) for 48h , and detecting the proliferative capacity of EPCs by MTT colorimetric assay ;
The apoptosis rate of EPCs was detected by annexin V - FITC method .
Cell reactive oxygen ( ROS ) level was detected by fluorescence probe ( DCFH - DA ) assay .

3 . The effects of APN on EPCs in high glucose environment were divided into 7 groups : 5 . 5mmol / l glucose , 5.5 mmol / l glucose + 24.5 mmol / l mannitol , 30 mmol / l glucose for 96 h . The rest 4 groups were treated with 30 mmol / l glucose for 48 hours . Then , the cells were harvested at 1.25 渭g / ml , 2.5 渭g / ml , 5 渭g / ml and 10 渭g / ml APN for 48 hours .

4 . Statistical treatment : Statistical analysis was carried out with SPSS 10.0 statistical software . The experimental data was expressed by X - ray - 鹵 s , and the data between the groups was ANOVA , P < 0.05 .

Results

1 . EPCs were cultured and identified : the peripheral blood mononuclear cells isolated from the density gradient centrifugation method were round and bright , short fusiform adherent cells appeared after 4 days of culture , and typical cell colonies were observed .
After 7 days of culture , the cell colonies increased obviously , and the spindle - shaped cells grew and grew in cross sex ;
Cell uptake of DiI - acLDL showed red fluorescence , the uptake of FITC - UEA - I was green fluorescence , the uptake of DiI - acLDL and the binding of FITC - UEA - I cells showed yellow fluorescence . The results of flow cytometry showed that the percentage of CD133 and CD34 + cells was 92.32 % , 10.7 % and 23.3 % , respectively .

2 . The effects of different sugar concentrations on EPCs were ( 0.287 鹵 0.031 ) , ( 0.252 鹵 0.034 ) , ( 0.242 鹵 0.019 ) , ( 0.215 鹵 0.081 ) , ( 0.208 鹵 0.098 ) % , ( 17.502 鹵 1.259 ) % , ( 0.208 鹵 0.098 ) % , ( 17.502 鹵 1.259 ) % , ( 0.208 鹵 0.098 ) % , ( 17.502 鹵 1.259 ) % , ( 0.208 鹵 0.098 ) % , ( 17.502 鹵 1.259 ) % , ( 0.208 鹵 0.098 ) , respectively .
When the concentration of sugar was 30 mmol / l and 50 mmol / l , there was no statistical difference between the two groups ( P0.05 ) .

3 . The effect of APN on EPCs after high glucose was analyzed . The results showed that the proliferation , migration , apoptosis and ROS level of EPCs were significantly higher than those in normal control group ( P0.05 ) .

Conclusion

1 . High glucose intervention can decrease the proliferation ability of EPCs and increase the apoptosis of EPCs .


2 . After high glucose intervention , APN , EPCs proliferation , migration ability recovery , cell apoptosis were reduced , and its effect increased with increasing concentration in a certain range ;


3 . High glucose can raise the level of ROS and function of EPCs , while APN can decrease the level of ROS and protect EPCs .
The osmotic pressure had no effect on EPCs .

【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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本文編號：1845386