本文選題：艱難梭菌 + 乙酰輔酶A合成通路��； 參考：《復旦大學》2011年博士論文

【摘要】：厭氧病原體艱難梭菌(Clostridium difficile)能夠直接感染人類導致結腸炎和結腸癌(簡稱為CDI),在北美和歐洲發(fā)現(xiàn)較多,發(fā)病率和死亡率較嚴重,目前在中國也已有報道。由于該病原體極度厭氧,對研究和疾病防治帶來較大困難。 艱難梭菌基因組測序結果表明：該病原體基因組中存在乙酰輔酶A合成通路(Wood-Ljungdah通路)中所有相關同源蛋白,主要包括甲基轉移酶、鈷鐵硫蛋白、乙酰輔酶A合成酶和一氧化碳脫氫酶等。該通路是許多厭氧微生物中重要的能源和物質代謝通路之一,并且不存在于人體中。因此,這些蛋白(酶)有可能成為治療Clostridium difficile所引發(fā)疾病的潛在藥物靶點。本文研究的主要目的是為病原體中該通路的后續(xù)詳細研究奠定基礎,并為相關藥物的開發(fā)提供設計思路。 本文研究了病原體C. difficile 630的乙酰輔酶A通路中的四種關鍵酶(蛋白),包括甲基轉移酶(MeTrCd,268個氨基酸)、鈷鐵硫蛋白(CoFeSPCd,包括兩個亞基delta和gamma,分別含314個氨基酸和455個氨基酸)、乙酰輔酶A合成酶(ACSCd,708個氨基酸)和一氧化碳脫氫酶(CODHCd,639個氨基酸)。 首先,我們研究了病原體C. difficile 630中編號為CD0727的甲基轉移酶基因(MeTrCd),包括基因克隆、重組表達與純化,成功建立了高效大腸桿菌表達純化體系(蛋白產量可達50 mg每升TB培養(yǎng)基)；使用圓二色光譜對其二級結構進行了表征；通過序列和結構分析及生物信息學,得到了其同源模擬結構。 研究了病原體C. difficile 630中編號為CD0725和CD0726(分別編碼鈷鐵硫蛋白gamma和delta亞基)的基因,通過基因克隆、重組表達與純化研究,成功建立了一套較為高效的重組表達體系；對CoFeSPCd的金屬中心Fe4S4和鉆胺素的化學重組進行了研究,并運用紫外可見光譜對其進行表征,實驗結果表明我們通過重組得到的CoFeSPCd是具有完整金屬中心的全蛋白。 通過色氨酸熒光淬滅光譜測定了甲基四氫葉酸的底物結合常數(shù),及其隨pH值減小的構象變化現(xiàn)象。實驗結果表明MeTrCd的底物結合能力與同源蛋白MeTrMt(來源于嗜熱菌Moorella thermoaceticum的MeTr)相比有顯著下降。該差異可能是由MeTrCd中底物結合位點腔His1l的存在造成的。色氨酸熒光淬滅光譜實驗表明MeTrCd存在pH依賴性的構象變化性質。該變化導致蛋白疏水區(qū)域的色氨酸殘基溶劑暴露程度加大,從而有利于底物結合及完成催化功能。 通過厭氧條件下的截流光譜技術詳細研究了MeTrCd的甲基轉移反應動力學,得到了MeTrCd與外源性CoFeSPMt(來源于嗜熱菌Moorella thermoaceticum的CoFeSP)和鉆銨素反應的米式方程動力學參數(shù)。通過厭氧條件下的截流光譜技術檢測了CoFeSPCd接受甲基的功能,并通過改變CoFeSPCd的濃度得到了以CoFeSPCd為底物的MeTrCd催化甲基動力學常數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)分別使用CoFeSPMt、鈷銨素和CoFeSPCd作為催化底物,無論是催化速率常數(shù)(Kcat)還是催化效率(Kcat/Km)都遵循這樣一個規(guī)律：CoFeSPMtCoFeSPCd鈷胺素。該規(guī)律進一步驗證了我們的推論即當使用MeTrCd-CoFeSPCd同源反應體系時,其相互作用的增強有利于甲基轉移反應的完成。采用計算機模擬分子對接研究對MeTr和CoFeSP的相互作用進行了研究,結果表明MeTr和CoFeSP相互作用有可能采取側面進攻(Conform3)的方式完成,并且CoFeSPCd與MeTrCd相互作用時的交界面處氨基酸的鹽橋、氫鍵等起了重要的穩(wěn)定作用。 本文詳細研究了乙酰輔酶A合成酶。首次建立了病原體C. difficile 630乙酰輔酶A合成酶(ACSCd)的大腸桿菌體外重組表達純化體系；通過金屬含量分析、紫外可見光譜以及EXAFS等光譜研究表明ACSCd在結構上具有ACSMt(來源于嗜熱菌Moorella thermoaceticum的ACS)的典型金屬活性中心A-cluster;活性測定實驗表明ACSCd的乙酰輔酶A合成活性速率常數(shù)為0.04μM min-1mg-1、甲基轉移酶活性速率常數(shù)為0.26±0.05 min-1；對ACSCd的抑制劑進行了初步的研究,并發(fā)現(xiàn)三種抑制劑均能有效抑制其活性；離體抑菌活性研究進一步驗證了它們對病原體C.difficile的抑制效果。這一研究具有十分重大的理論意義和應用價值,有可能成為尋找治療CDI疾病藥物的一個新策略。 此外,我們對一氧化碳脫氫酶的基因克隆、蛋白質重組表達純化進行了初步的研究探索。一氧化碳脫氫酶(CODH)的功能是催化CO和CO2的可逆氧化還原,它是乙酰輔酶A通路中的重要金屬酶之一,但是該蛋白很容易以包涵體沉淀的形式存在,人們一直未能建立該蛋白的大腸桿菌表達體系。本文通過構建多個原核表達質粒,對嗜熱菌Moorella thermoacetica的CODHMt以及病原體CODHCd的重組表達純化進行了一系列的探索,我們得到了含有麥芽糖融合標簽的蛋白。這一研究為將來詳細研究CODH的結構與功能奠定了基礎。 總之,本文對艱難梭菌(Clostridium difficile)乙酰輔酶A合成通路中的四種關鍵酶(蛋白)進行了基因構建、重組表達與純化的研究探索,成功得到了其中3種酶(蛋白)的高效表達純化體系,并進行了詳細的結構、功能與性質及抑制劑的研究。該研究不僅增進了人們對該病原體的認識和對乙酰輔酶A合成通路的了解、而且為開發(fā)新型治療CDI藥物提供了理論依據(jù)和思路。
[Abstract]:Clostridium difficile, an anaerobic pathogen, can directly infect humans and lead to colitis and colon cancer (called CDI). It has been found more in North America and Europe, with severe morbidity and mortality, and is also reported in China. The pathogen is extremely difficult for research and disease control because of the extreme anaerobic condition of the pathogen.
The genome sequencing of Clostridium difficile showed that the pathogen genome exists all related homologous proteins in the acetyl coenzyme A pathway (Wood-Ljungdah pathway), mainly including methyltransferase, cobalt iron sulphide protein, acetyl coenzyme A synthetase, and carbon monoxide dehydrogenase, which are important energy and substances in many anaerobic microorganisms. It is one of the metabolic pathways and does not exist in the human body. Therefore, these proteins (enzymes) may be potential drug targets for the treatment of Clostridium difficile diseases. The main purpose of this study is to lay the foundation for subsequent detailed study of the pathway in the pathogen and to provide a design idea for the development of related drugs.
This paper has studied four key enzymes (proteins) in the acetyl coenzyme A pathway of the pathogen C. difficile 630, including methyl transferase (MeTrCd, 268 amino acids), cobalt ferrothioprotein (CoFeSPCd, two subunits Delta and gamma, 314 amino acids and 455 amino acids respectively), acetyl coenzyme A synthetase (ACSCd, 708 amino acids) and carbon monoxide. Dehydrogenase (CODHCd, 639 amino acids).
First, we studied the methyltransferase gene (MeTrCd), numbered CD0727 in the pathogen C. difficile 630, including gene cloning, recombinant expression and purification. The expression and purification system of high efficiency Escherichia coli (protein yield up to 50 mg per liter TB medium) was successfully established, and the secondary structure was characterized by circular two color spectrum; Sequence and structural analysis and bioinformatics obtained their homologous structure.
The gene C. difficile 630, numbered with CD0725 and CD0726 (encoding cobalt iron sulphur protein gamma and delta subunit respectively), was studied by gene cloning, recombinant expression and purification. A set of more efficient recombinant expression system was successfully established, and the chemical recombination of the metal center Fe4S4 and TW of CoFeSPCd was studied. It was characterized by UV Vis spectroscopy. The results showed that the CoFeSPCd obtained by recombination was a complete protein with a complete metal center.
By fluorescence quenching of tryptophan, the substrate binding constant and the conformation change with the pH value of methylenetetrahydrofolate were measured. The experimental results showed that the substrate binding capacity of MeTrCd was significantly lower than that of the homologous protein MeTrMt (from the MeTr of thermophilic Moorella thermoaceticum). This difference may be from the substrate in MeTrCd. The fluorescence quenching spectra of tryptophan showed that the presence of His1l in the site of the site of tryptophan showed that there was a pH dependent conformation change in MeTrCd, which resulted in the increased exposure of tryptophan residues in the hydrophobic region of the protein, which was beneficial to the substrate binding and the catalytic function.
The kinetic parameters of methyl transfer reaction of MeTrCd were studied in detail by intercepting spectroscopy under anaerobic conditions. The kinetic parameters of MeTrCd and CoFeSPMt (CoFeSP derived from thermophilic Moorella thermoaceticum) and ammonium drilling were obtained. The CoFeSPCd acceptance was detected by the interception spectrum technique under anaerobic conditions. The function of the base was obtained by changing the concentration of CoFeSPCd to catalyze the methyl kinetic constant of MeTrCd with CoFeSPCd as the substrate. It was found that using CoFeSPMt, cobaltin and CoFeSPCd as a catalytic substrate, both the catalytic rate constant (Kcat) and the catalytic efficiency (Kcat/Km) all follow such a rule: CoFeSPMtCoFeSPCd cobalt amide. This rule further validates our inference that the enhancement of interaction is beneficial to the completion of the methyl transfer reaction when using the MeTrCd-CoFeSPCd homologous reaction system. The interaction between MeTr and CoFeSP is studied by computer simulation molecular docking. The results show that the interaction between MeTr and CoFeSP may take side into the side. The way of attack (Conform3) is completed, and the salt bridge and hydrogen bond of the amino acid interface at the interface between CoFeSPCd and MeTrCd play an important stabilizing role.
In this paper, the acetyl coenzyme A synthetase was studied in detail. The recombinant expression and purification system of Escherichia coli was established for the first time by the pathogen C. difficile 630 acetyl coenzyme A synthetase (ACSCd). Through the analysis of metal content, UV visible spectrum and EXAFS, it showed that ACSCd had ACSMt (from the thermophilic Moorella thermoa) in the structure. The typical metal active center A-cluster of ACS of ceticum; the activity determination experiment showed that the rate constant of ACSCd acetyl coenzyme A synthesis activity was 0.04 u M min-1mg-1, the rate constant of methyltransferase was 0.26 + 0.05 min-1; the inhibitor of ACSCd was preliminarily studied, and all three inhibitors could effectively inhibit its activity; The study of body inhibitory activity further verified their inhibitory effect on the pathogen C.difficile. This study is of great theoretical significance and application value, and may become a new strategy for the search for drugs for the treatment of CDI disease.
In addition, we have studied the gene cloning of CO dehydrogenase and the recombinant protein expression and purification. The function of carbon monoxide dehydrogenase (CODH) is to catalyze the reversible redox of CO and CO2. It is one of the important metal enzymes in the acetyl coenzyme A pathway, but it is easy to exist in the form of inclusion body precipitation. We have been unable to establish the protein expression system of Escherichia coli. In this paper, a number of prokaryotic expression plasmids were constructed, and a series of studies on the recombinant expression and purification of the thermophilic Moorella thermoacetica CODHMt and the pathogen CODHCd were carried out. We have obtained the protein containing maltose fusion label. It lays the foundation for the structure and function of CODH.
In a word, four key enzymes (proteins) in the Clostridium difficile acetyl coenzyme A synthesis pathway were constructed, the recombinant expression and purification were studied. The efficient expression and purification system of 3 enzymes (proteins) was successfully obtained, and the detailed structure, function and properties and inhibitors were studied. The study not only enhances the understanding of the pathogen and the understanding of the acetyl coenzyme A synthesis pathway, but also provides a theoretical basis and ideas for the development of a new treatment of CDI drugs.

【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R346

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