本文選題：金屬蛋白酶組織抑制因子-3 + 樹突狀細(xì)胞　； 參考：《山東大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：研究目的： 1.研究觀察TIMP-3在人外周血單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞(DCs)分化過程中的表達(dá)以及成熟刺激對(duì)DCs表達(dá)TIMP-3的影響,探討TIMP-3在DCs分化過程中誘導(dǎo)性表達(dá)的機(jī)制。 2.研究觀察TIMP-3對(duì)LPS刺激成熟的人單核細(xì)胞來源DCs的表型以及細(xì)胞因子分泌的影響,探討TIMP-3抑制DCs表面共刺激分子CD86表達(dá)以及細(xì)胞因子IL-12分泌的機(jī)制。 3.研究觀察TIMP-3對(duì)LPS刺激成熟的人單核細(xì)胞來源DCs誘導(dǎo)初始T細(xì)胞極化能力和方向的影響,探討TIMP-3對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答類型的影響,為以TIMP-3為基礎(chǔ)的抗腫瘤治療研究提供免疫學(xué)理論基礎(chǔ)。 研究方法： 1.以人單核來源的DCs為研究對(duì)象,分別在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測(cè)單核細(xì)胞向DCs分化過程中TIMP-3的表達(dá)。 取健康志愿者的外周血濃縮粒細(xì)胞,采用密度梯度離心法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞,CD14+磁珠分選純化獲得外周血單核細(xì)胞。純化后的外周血單核細(xì)胞在含有IL-4,GM-CSF和10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)5天成為未成熟DCs(imDCs),加入LPS或TNF-a繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),刺激形成成熟DCs (mDCs)。在單核細(xì)胞向DCs誘導(dǎo)的第0、1、3、5天和第7天,取細(xì)胞采用RT-PCR檢測(cè)TIMP-3mRNA的表達(dá)。取新鮮分離的單核細(xì)胞和imDCs進(jìn)行免疫熒光染色,采用激光共聚焦顯微鏡觀察TIMP-3蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位。采用ELISA方法檢測(cè)imDC培養(yǎng)上清中TIMP-3的分泌。 2.以人單核來源的DCs為研究對(duì)象,探討單核細(xì)胞向DCs分化過程中TIMP-3誘導(dǎo)性表達(dá)的機(jī)制 分別采用標(biāo)準(zhǔn)濃度的IL-4配合梯度濃度的GM-CSF或梯度濃度的IL-4配合標(biāo)準(zhǔn)濃度的GM-CSF誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化,于培養(yǎng)第5天收集細(xì)胞,qRT-PCR方法檢測(cè)TIMP-3mRNA的表達(dá),以確定IL-4和GM-CSF在誘導(dǎo)TIMP-3表達(dá)中各自的作用。采用p38MAPK抑制劑SB203580、JAK3抑制劑ZAM39923或PI3K抑制劑wortmannin預(yù)處理單核細(xì)胞1小時(shí),PBS洗三遍后,再采用IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)細(xì)胞分化3天,收取細(xì)胞用qRT-PCR方法檢測(cè)TIMP-3mRNA的表達(dá)。分別采用標(biāo)準(zhǔn)濃度的IL-4或GM-CSF誘導(dǎo)單核細(xì)胞0、5、15、30和60分鐘,收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白后,應(yīng)用western-blot方法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)磷酸化p38和總p38的表達(dá)量,分析p38的磷酸化水平變化。以p38MAPK抑制劑預(yù)處理單核細(xì)胞1小時(shí),后用標(biāo)準(zhǔn)濃度的IL-4誘導(dǎo)60分鐘,然后采用p38MAPK活性分析試劑盒檢測(cè)p38MAPK激酶活性。 3.以人單核細(xì)胞來源DCs為研究對(duì)象,采用脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染沉默DCs中TIMP-3基因的表達(dá) 以脂質(zhì)體為載體轉(zhuǎn)染siRNA沉默DCs中TIMP-3的表達(dá)。取imDCs經(jīng)PBS洗滌后,加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性載體對(duì)照組和干擾組,分別加入Lipofectamine2000、陰性對(duì)照siRNA和TIMP-3siRNA,室溫孵育4小時(shí)后加入含IL-4、GM-CSF和LPS的全陪,繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞,提取總蛋白用western-blot檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中TIMP-3蛋白表達(dá)水平,計(jì)算TIMP-3沉默效率。 4.外源性rhTIMP-3或TIMP-3基因沉默對(duì)LPS促成熟DCs表面標(biāo)志表達(dá)及細(xì)胞因子分泌影響的檢測(cè) 以IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)第5天的imDCs為研究對(duì)象,在LPS刺激其成熟的過程中同時(shí)加入人重組TIMP-3,作用48小時(shí)后收集細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs表面成熟標(biāo)志及共刺激分子HLA-DR、CD14、CD40、CD80、CD83和CD86的表達(dá)；收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,高速離心后采用懸浮芯片技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α分泌水平。收集TIMP-3siRNA轉(zhuǎn)染沉默后的imDCs,以LPS刺激48小時(shí)促成熟后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs表面成熟標(biāo)志及共刺激分子HLA-DR、CD14、CD40、 CD80、CD83和CD86的表達(dá)；收集干擾后DCs培養(yǎng)上清,高速離心后采用懸浮芯片技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α分泌水平。 5.探討分析TIMP-3抑制LPS促成熟DCs表面共刺激分子CD86表達(dá)和細(xì)胞因子IL-12分泌的機(jī)制 采用不同濃度的PI3K抑制劑wortmannin或?qū)φ誅MSO預(yù)處理imDCs1小時(shí),PBS洗滌后,采用LPS或LPS加TIMP-3刺激48小時(shí)促進(jìn)DCs成熟。收集DCs培養(yǎng)上清,高速離心后采用懸浮芯片技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α分泌水平。采用500nM wortmannin或?qū)φ誅MSO預(yù)處理imDCs1小時(shí),PBS洗滌后,采用LPS或LPS加TIMP-3刺激48小時(shí)促DCs成熟,分別在刺激過程中的第0、6、12、24和48小時(shí),收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,高速離心后采用懸浮芯片技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子IL-12分泌水平；收集促成熟48小時(shí)后的各組DCs,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面共刺激分子CD86的表達(dá)。imDCs經(jīng)LPS或LPS加TIMP-3刺激30分鐘,收集細(xì)胞提取總蛋白后,采用western-blot技術(shù)檢測(cè)Akt磷酸化蛋白水平。imDCs經(jīng)TNF-α或LPS或LPS加TIMP-3刺激48促成熟,分別在刺激過程中的第2、4、8、16、24和48小時(shí)的細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)MARCH1mRNA的表達(dá)。 6.外源性rhTIMP-3或TIMP-3基因沉默對(duì)LPS促成熟DCs誘導(dǎo)初始T細(xì)胞極化能力及方向影響的檢測(cè) 取健康志愿者的外周血濃縮粒細(xì)胞,采用密度梯度離心法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞,D4+CD45RA+T細(xì)胞陰性磁珠分選法純化外周血初始T細(xì)胞。純化后的初始T細(xì)胞與不同條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)的成熟DC,按照5：1的比例混合共培養(yǎng)6天,收集培養(yǎng)上清,懸浮芯片檢測(cè)Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和Thl細(xì)胞因子IFN-γ的分泌水平；或于混合培養(yǎng)第6天,在brefeldin A存在的環(huán)境中,加入PMA和ionomycin繼續(xù)培養(yǎng)5-6小時(shí),細(xì)胞經(jīng)固定破膜后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)IL-4和IFN-γ的水平。 結(jié)果： 1.單核細(xì)胞不表達(dá)TIMP-3, TIMP-3在單核細(xì)胞向DCs分化的過程中呈誘導(dǎo)性表達(dá)特征 RT-PCR結(jié)果顯示,新鮮分離的人外周血單核細(xì)胞不表達(dá)TIMP-3mRNA,在IL-4和GM-CSF刺激單核細(xì)胞向DCs分化的過程中,TIMP-3呈誘導(dǎo)性表達(dá)。imDCs經(jīng)LPS或TNF-α刺激成熟后,TIMP-3的表達(dá)降低(P0.05)。免疫熒光檢測(cè)顯示,單核細(xì)胞不表達(dá)TIMP-3蛋白,imDCs中表達(dá)的TIMP-3位于胞漿內(nèi)和細(xì)胞核內(nèi)。ELISA檢測(cè)imDCs培養(yǎng)上清,未檢測(cè)到TIMP-3;若采用肝素孵育imDCs8小時(shí),或采用Triton X-100或SDS處理imDCs5分鐘,上清中可檢測(cè)到TIMP-3的表達(dá)。 2.在單核細(xì)胞向DCs分化過程中,IL-4通過激活p38MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)TIMP-3的表達(dá) 采用標(biāo)準(zhǔn)濃度的GM-CSF培養(yǎng)梯度濃度的IL-4誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化,結(jié)果顯示隨著IL-4濃度的提高,轉(zhuǎn)錄水平TIMP-3的表達(dá)逐漸增加。而采用標(biāo)準(zhǔn)濃度的IL-4配合梯度濃度的GM-CSF誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化,轉(zhuǎn)錄水平TIMP-3的表達(dá)各組無顯著差異,提示IL-4在TIMP-3的誘導(dǎo)性表達(dá)中起決定作用。采用p38MAPK信號(hào)通路抑制劑SB203580預(yù)處理單核細(xì)胞后,IL-4誘導(dǎo)TIMP-3表達(dá)的能力顯著降低(P0.05)。而JAK3抑制劑ZM39923和P13K抑制劑wortmannin預(yù)處理對(duì)IL-4誘導(dǎo)TIMP-3的表達(dá)無顯著影響。Western-blot結(jié)果顯示,GM-CSF不影響單核細(xì)胞p38MAPK磷酸化水平,而IL-4則誘導(dǎo)單核細(xì)胞p38MAPK磷酸化顯著增強(qiáng)。p38MAPK活性分析顯示,IL-4能夠顯著增強(qiáng)p38MAPK的激酶活性,其抑制劑SB203580顯著抑制其活性。 3.脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染有效沉默DCs中TIMP-3基因的表達(dá) 采用western-blot檢測(cè)脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染沉默DCs中TIMP-3表達(dá)的效率。結(jié)果顯示,RNA干擾基因沉默TIMP-3后,DCs表達(dá)TIMP-3蛋白顯著降低(P0.05),降低水平超過50%。 4.TIMP-3抑制LPS刺激成熟DCs表面共刺激分子CD86的表達(dá),抑制DCs分泌細(xì)胞因子IL-12 收集單一LPS刺激成熟的DCs, LPS加rhTIMP-3刺激成熟的DCs以及TIMP-3基因沉默后的經(jīng)LPS刺激成熟的DCs,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面成熟標(biāo)志及共刺激分子的表達(dá),結(jié)果顯示TIMP-3不影響DCs表面HLA-DR、CD14、CD40、CD80和CD83的表達(dá),但顯著降低共刺激分子CD86的表達(dá),而TIMP-3基因沉默顯著增強(qiáng)CD86的表達(dá)。懸浮芯片細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示,TIMP-3單一刺激不能改變DCs細(xì)胞因子的分泌,而TIMP-3可以顯著抑制LPS刺激的IL-12和TNF-α的產(chǎn)生(P0.05),不影響LPS刺激的IL-1β、IL-6和IL-10的產(chǎn)生;TIMP-3基因沉默后以LPS刺激DCs使IL-12和TNF-a的產(chǎn)生顯著增加(P0.05)。 5. TIMP-3通過進(jìn)一步激活PI3K信號(hào)通路抑制LPS刺激成熟的DCs分泌IL-12,通過抑制LPS刺激引起的MARCH1表達(dá)降低增強(qiáng)CD86的泛素化 采用不同濃度P13K抑制劑wortmannin預(yù)處理imDCs后,TIMP-3抑制LPS刺激的IL-12產(chǎn)生的效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。500nM wortmannin能夠完全逆轉(zhuǎn)TIMP-3對(duì)IL-12的抑制效應(yīng),而對(duì)IL-10和TNF-a在TIMP-3存在的情況下的分泌無顯著影響。動(dòng)態(tài)IL-12分泌結(jié)果顯示,第6小時(shí)1L-12的分泌恢復(fù)至正常水平。檢測(cè)PI3K下游信號(hào)分子Akt的磷酸化水平結(jié)果顯示,TIMP-3能顯著增強(qiáng)Akt的磷酸化。Wortmannin預(yù)處理DCs雖能恢復(fù)IL-12的分泌,但并不能恢復(fù)TIMP-3引起的DCs表面CD86的表達(dá)抑制,相反是進(jìn)一步降低CD86的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)與DCs表面CD86泛素化密切相關(guān)的分子MARCH1的表達(dá)結(jié)果顯示,TIMP-3能夠顯著抑制LPS刺激引起的MARCH1表達(dá)降低,因此推測(cè)TIMP-3可能通過MARCH1介導(dǎo)的泛素化降低CD86的表達(dá)。 6. TIMP-3使LPS刺激成熟的DCs誘導(dǎo)的初始T細(xì)胞呈Th2偏倚 不同條件下誘導(dǎo)成熟的DCs與初始T細(xì)胞共培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)結(jié)果顯示,TIMP-3顯著降低產(chǎn)IFN-γ細(xì)胞的比例,顯著增強(qiáng)產(chǎn)IL-4細(xì)胞的比例。懸浮芯片檢測(cè)上清中細(xì)胞因子分泌結(jié)果顯示,TIMP-3顯著降低IFN-γ的分泌,顯著增強(qiáng)IL-4的分泌。導(dǎo)致IL-4/IFN-γ、IL-5/IFN-γ、IL-10/IFN-γ和IL-13/IFN-γ的比例增大,誘導(dǎo)的T細(xì)胞呈明顯Th2偏倚。Wortmannin預(yù)處理DCs逆轉(zhuǎn)了TIMP-3的上述效應(yīng)。 結(jié)論： 1.單核細(xì)胞不表達(dá)TIMP-3,在向DCs分化過程中,IL-4通過激活p38MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)TIMP-3的表達(dá)。LPS或TNF-a介導(dǎo)的成熟刺激使DCs中TIMP-3的表達(dá)降低。 2. TIMP-3抑制LPS刺激成熟DCs表面共刺激分子CD86的表達(dá)和細(xì)胞因子IL-12的分泌,這提示TIMP-3可能改變LPS刺激成熟DCs的誘導(dǎo)初始T細(xì)胞極化的能力和方向。 3. TIMP-3通過進(jìn)一步激活PI3K信號(hào)通路抑制LPS刺激成熟DCs分泌細(xì)胞因子IL-12。 4. TIMP-3可能通過抑制LPS引起的MARCH1表達(dá)降低,從而增強(qiáng)由MARCH1介導(dǎo)的CD86泛素化效應(yīng),使CD86的表達(dá)降低。 5. TIMP-3使LPS刺激成熟的DCs誘導(dǎo)的初始T細(xì)胞向Th2方向極化。因此,以TIMP-3為基礎(chǔ)的抗腫瘤治療研究的效果尚需進(jìn)一步評(píng)價(jià)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392.1

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 周催;利用動(dòng)物模型研究食物潛在致敏性及其致敏機(jī)理[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：1832929