本文選題：金屬蛋白酶組織抑制因子-3 + 樹突狀細胞　； 參考：《山東大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：研究目的： 1.研究觀察TIMP-3在人外周血單核細胞向樹突狀細胞(DCs)分化過程中的表達以及成熟刺激對DCs表達TIMP-3的影響,探討TIMP-3在DCs分化過程中誘導(dǎo)性表達的機制。 2.研究觀察TIMP-3對LPS刺激成熟的人單核細胞來源DCs的表型以及細胞因子分泌的影響,探討TIMP-3抑制DCs表面共刺激分子CD86表達以及細胞因子IL-12分泌的機制。 3.研究觀察TIMP-3對LPS刺激成熟的人單核細胞來源DCs誘導(dǎo)初始T細胞極化能力和方向的影響,探討TIMP-3對T淋巴細胞免疫應(yīng)答類型的影響,為以TIMP-3為基礎(chǔ)的抗腫瘤治療研究提供免疫學(xué)理論基礎(chǔ)。 研究方法： 1.以人單核來源的DCs為研究對象,分別在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測單核細胞向DCs分化過程中TIMP-3的表達。 取健康志愿者的外周血濃縮粒細胞,采用密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞,CD14+磁珠分選純化獲得外周血單核細胞。純化后的外周血單核細胞在含有IL-4,GM-CSF和10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)5天成為未成熟DCs(imDCs),加入LPS或TNF-a繼續(xù)培養(yǎng)48小時,刺激形成成熟DCs (mDCs)。在單核細胞向DCs誘導(dǎo)的第0、1、3、5天和第7天,取細胞采用RT-PCR檢測TIMP-3mRNA的表達。取新鮮分離的單核細胞和imDCs進行免疫熒光染色,采用激光共聚焦顯微鏡觀察TIMP-3蛋白的表達和細胞定位。采用ELISA方法檢測imDC培養(yǎng)上清中TIMP-3的分泌。 2.以人單核來源的DCs為研究對象,探討單核細胞向DCs分化過程中TIMP-3誘導(dǎo)性表達的機制 分別采用標準濃度的IL-4配合梯度濃度的GM-CSF或梯度濃度的IL-4配合標準濃度的GM-CSF誘導(dǎo)單核細胞分化,于培養(yǎng)第5天收集細胞,qRT-PCR方法檢測TIMP-3mRNA的表達,以確定IL-4和GM-CSF在誘導(dǎo)TIMP-3表達中各自的作用。采用p38MAPK抑制劑SB203580、JAK3抑制劑ZAM39923或PI3K抑制劑wortmannin預(yù)處理單核細胞1小時,PBS洗三遍后,再采用IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)細胞分化3天,收取細胞用qRT-PCR方法檢測TIMP-3mRNA的表達。分別采用標準濃度的IL-4或GM-CSF誘導(dǎo)單核細胞0、5、15、30和60分鐘,收集細胞提取細胞總蛋白后,應(yīng)用western-blot方法檢測各時間點磷酸化p38和總p38的表達量,分析p38的磷酸化水平變化。以p38MAPK抑制劑預(yù)處理單核細胞1小時,后用標準濃度的IL-4誘導(dǎo)60分鐘,然后采用p38MAPK活性分析試劑盒檢測p38MAPK激酶活性。 3.以人單核細胞來源DCs為研究對象,采用脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染沉默DCs中TIMP-3基因的表達 以脂質(zhì)體為載體轉(zhuǎn)染siRNA沉默DCs中TIMP-3的表達。取imDCs經(jīng)PBS洗滌后,加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基。將細胞分為空白對照組、陰性載體對照組和干擾組,分別加入Lipofectamine2000、陰性對照siRNA和TIMP-3siRNA,室溫孵育4小時后加入含IL-4、GM-CSF和LPS的全陪,繼續(xù)培養(yǎng)48小時后收集細胞,提取總蛋白用western-blot檢測不同實驗組中TIMP-3蛋白表達水平,計算TIMP-3沉默效率。 4.外源性rhTIMP-3或TIMP-3基因沉默對LPS促成熟DCs表面標志表達及細胞因子分泌影響的檢測 以IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)第5天的imDCs為研究對象,在LPS刺激其成熟的過程中同時加入人重組TIMP-3,作用48小時后收集細胞,用流式細胞儀檢測DCs表面成熟標志及共刺激分子HLA-DR、CD14、CD40、CD80、CD83和CD86的表達；收集細胞培養(yǎng)上清,高速離心后采用懸浮芯片技術(shù)檢測細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α分泌水平。收集TIMP-3siRNA轉(zhuǎn)染沉默后的imDCs,以LPS刺激48小時促成熟后,用流式細胞儀檢測DCs表面成熟標志及共刺激分子HLA-DR、CD14、CD40、 CD80、CD83和CD86的表達；收集干擾后DCs培養(yǎng)上清,高速離心后采用懸浮芯片技術(shù)檢測細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α分泌水平。 5.探討分析TIMP-3抑制LPS促成熟DCs表面共刺激分子CD86表達和細胞因子IL-12分泌的機制 采用不同濃度的PI3K抑制劑wortmannin或?qū)φ誅MSO預(yù)處理imDCs1小時,PBS洗滌后,采用LPS或LPS加TIMP-3刺激48小時促進DCs成熟。收集DCs培養(yǎng)上清,高速離心后采用懸浮芯片技術(shù)檢測細胞因子IL-10、IL-12和TNF-α分泌水平。采用500nM wortmannin或?qū)φ誅MSO預(yù)處理imDCs1小時,PBS洗滌后,采用LPS或LPS加TIMP-3刺激48小時促DCs成熟,分別在刺激過程中的第0、6、12、24和48小時,收集細胞培養(yǎng)上清,高速離心后采用懸浮芯片技術(shù)檢測細胞因子IL-12分泌水平；收集促成熟48小時后的各組DCs,采用流式細胞儀檢測細胞表面共刺激分子CD86的表達。imDCs經(jīng)LPS或LPS加TIMP-3刺激30分鐘,收集細胞提取總蛋白后,采用western-blot技術(shù)檢測Akt磷酸化蛋白水平。imDCs經(jīng)TNF-α或LPS或LPS加TIMP-3刺激48促成熟,分別在刺激過程中的第2、4、8、16、24和48小時的細胞,提取細胞總RNA,應(yīng)用RT-PCR方法檢測MARCH1mRNA的表達。 6.外源性rhTIMP-3或TIMP-3基因沉默對LPS促成熟DCs誘導(dǎo)初始T細胞極化能力及方向影響的檢測 取健康志愿者的外周血濃縮粒細胞,采用密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞,D4+CD45RA+T細胞陰性磁珠分選法純化外周血初始T細胞。純化后的初始T細胞與不同條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)的成熟DC,按照5：1的比例混合共培養(yǎng)6天,收集培養(yǎng)上清,懸浮芯片檢測Th2細胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和Thl細胞因子IFN-γ的分泌水平；或于混合培養(yǎng)第6天,在brefeldin A存在的環(huán)境中,加入PMA和ionomycin繼續(xù)培養(yǎng)5-6小時,細胞經(jīng)固定破膜后采用流式細胞儀檢測胞內(nèi)IL-4和IFN-γ的水平。 結(jié)果： 1.單核細胞不表達TIMP-3, TIMP-3在單核細胞向DCs分化的過程中呈誘導(dǎo)性表達特征 RT-PCR結(jié)果顯示,新鮮分離的人外周血單核細胞不表達TIMP-3mRNA,在IL-4和GM-CSF刺激單核細胞向DCs分化的過程中,TIMP-3呈誘導(dǎo)性表達。imDCs經(jīng)LPS或TNF-α刺激成熟后,TIMP-3的表達降低(P0.05)。免疫熒光檢測顯示,單核細胞不表達TIMP-3蛋白,imDCs中表達的TIMP-3位于胞漿內(nèi)和細胞核內(nèi)。ELISA檢測imDCs培養(yǎng)上清,未檢測到TIMP-3;若采用肝素孵育imDCs8小時,或采用Triton X-100或SDS處理imDCs5分鐘,上清中可檢測到TIMP-3的表達。 2.在單核細胞向DCs分化過程中,IL-4通過激活p38MAPK信號通路誘導(dǎo)TIMP-3的表達 采用標準濃度的GM-CSF培養(yǎng)梯度濃度的IL-4誘導(dǎo)單核細胞分化,結(jié)果顯示隨著IL-4濃度的提高,轉(zhuǎn)錄水平TIMP-3的表達逐漸增加。而采用標準濃度的IL-4配合梯度濃度的GM-CSF誘導(dǎo)單核細胞分化,轉(zhuǎn)錄水平TIMP-3的表達各組無顯著差異,提示IL-4在TIMP-3的誘導(dǎo)性表達中起決定作用。采用p38MAPK信號通路抑制劑SB203580預(yù)處理單核細胞后,IL-4誘導(dǎo)TIMP-3表達的能力顯著降低(P0.05)。而JAK3抑制劑ZM39923和P13K抑制劑wortmannin預(yù)處理對IL-4誘導(dǎo)TIMP-3的表達無顯著影響。Western-blot結(jié)果顯示,GM-CSF不影響單核細胞p38MAPK磷酸化水平,而IL-4則誘導(dǎo)單核細胞p38MAPK磷酸化顯著增強。p38MAPK活性分析顯示,IL-4能夠顯著增強p38MAPK的激酶活性,其抑制劑SB203580顯著抑制其活性。 3.脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染有效沉默DCs中TIMP-3基因的表達 采用western-blot檢測脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染沉默DCs中TIMP-3表達的效率。結(jié)果顯示,RNA干擾基因沉默TIMP-3后,DCs表達TIMP-3蛋白顯著降低(P0.05),降低水平超過50%。 4.TIMP-3抑制LPS刺激成熟DCs表面共刺激分子CD86的表達,抑制DCs分泌細胞因子IL-12 收集單一LPS刺激成熟的DCs, LPS加rhTIMP-3刺激成熟的DCs以及TIMP-3基因沉默后的經(jīng)LPS刺激成熟的DCs,采用流式細胞術(shù)檢測其表面成熟標志及共刺激分子的表達,結(jié)果顯示TIMP-3不影響DCs表面HLA-DR、CD14、CD40、CD80和CD83的表達,但顯著降低共刺激分子CD86的表達,而TIMP-3基因沉默顯著增強CD86的表達。懸浮芯片細胞因子檢測結(jié)果顯示,TIMP-3單一刺激不能改變DCs細胞因子的分泌,而TIMP-3可以顯著抑制LPS刺激的IL-12和TNF-α的產(chǎn)生(P0.05),不影響LPS刺激的IL-1β、IL-6和IL-10的產(chǎn)生;TIMP-3基因沉默后以LPS刺激DCs使IL-12和TNF-a的產(chǎn)生顯著增加(P0.05)。 5. TIMP-3通過進一步激活PI3K信號通路抑制LPS刺激成熟的DCs分泌IL-12,通過抑制LPS刺激引起的MARCH1表達降低增強CD86的泛素化 采用不同濃度P13K抑制劑wortmannin預(yù)處理imDCs后,TIMP-3抑制LPS刺激的IL-12產(chǎn)生的效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。500nM wortmannin能夠完全逆轉(zhuǎn)TIMP-3對IL-12的抑制效應(yīng),而對IL-10和TNF-a在TIMP-3存在的情況下的分泌無顯著影響。動態(tài)IL-12分泌結(jié)果顯示,第6小時1L-12的分泌恢復(fù)至正常水平。檢測PI3K下游信號分子Akt的磷酸化水平結(jié)果顯示,TIMP-3能顯著增強Akt的磷酸化。Wortmannin預(yù)處理DCs雖能恢復(fù)IL-12的分泌,但并不能恢復(fù)TIMP-3引起的DCs表面CD86的表達抑制,相反是進一步降低CD86的表達。RT-PCR檢測與DCs表面CD86泛素化密切相關(guān)的分子MARCH1的表達結(jié)果顯示,TIMP-3能夠顯著抑制LPS刺激引起的MARCH1表達降低,因此推測TIMP-3可能通過MARCH1介導(dǎo)的泛素化降低CD86的表達。 6. TIMP-3使LPS刺激成熟的DCs誘導(dǎo)的初始T細胞呈Th2偏倚 不同條件下誘導(dǎo)成熟的DCs與初始T細胞共培養(yǎng),流式細胞術(shù)檢測胞內(nèi)細胞因子表達結(jié)果顯示,TIMP-3顯著降低產(chǎn)IFN-γ細胞的比例,顯著增強產(chǎn)IL-4細胞的比例。懸浮芯片檢測上清中細胞因子分泌結(jié)果顯示,TIMP-3顯著降低IFN-γ的分泌,顯著增強IL-4的分泌。導(dǎo)致IL-4/IFN-γ、IL-5/IFN-γ、IL-10/IFN-γ和IL-13/IFN-γ的比例增大,誘導(dǎo)的T細胞呈明顯Th2偏倚。Wortmannin預(yù)處理DCs逆轉(zhuǎn)了TIMP-3的上述效應(yīng)。 結(jié)論： 1.單核細胞不表達TIMP-3,在向DCs分化過程中,IL-4通過激活p38MAPK信號通路誘導(dǎo)TIMP-3的表達。LPS或TNF-a介導(dǎo)的成熟刺激使DCs中TIMP-3的表達降低。 2. TIMP-3抑制LPS刺激成熟DCs表面共刺激分子CD86的表達和細胞因子IL-12的分泌,這提示TIMP-3可能改變LPS刺激成熟DCs的誘導(dǎo)初始T細胞極化的能力和方向。 3. TIMP-3通過進一步激活PI3K信號通路抑制LPS刺激成熟DCs分泌細胞因子IL-12。 4. TIMP-3可能通過抑制LPS引起的MARCH1表達降低,從而增強由MARCH1介導(dǎo)的CD86泛素化效應(yīng),使CD86的表達降低。 5. TIMP-3使LPS刺激成熟的DCs誘導(dǎo)的初始T細胞向Th2方向極化。因此,以TIMP-3為基礎(chǔ)的抗腫瘤治療研究的效果尚需進一步評價。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392.1

【引證文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 周催;利用動物模型研究食物潛在致敏性及其致敏機理[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

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本文編號：1832929