本文選題：登革病毒 + 人胚肺二倍體細胞��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2012年碩士論文

【摘要】：登革病毒(dengue virus,DEN)屬于黃病毒科黃病毒屬中的一個血清型亞群,主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊等媒介昆蟲傳播,引起登革熱(dengue fever,DF)以及發(fā)病率和死亡率很高的登革出血熱(dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克綜合征(dengue shock syndrome,DSS)。尤其近年來,由于全球氣候變暖、人口流動頻繁等因素,登革熱在全世界的發(fā)病率提高了近30倍。在過去兩年中全球登革熱感染人群的數量持續(xù)增長,在東南亞中部和南部地區(qū)、美國以及南太平洋地區(qū),每年約8000萬人感染登革病毒,估計24000人死亡,超過100個國家的30億人受到威脅,已成為世界性的公共衛(wèi)生問題。迄今為止全球仍沒有獲準上市的登革病毒疫苗,因此登革疫苗研發(fā)迫在眉睫。目前最有潛力的傳統(tǒng)減毒活疫苗候選株是由泰國沃特瑞德研究所(WRAIR)研發(fā)的以犬腎細胞和恒河猴胚肺細胞為基質的疫苗[3],Vero細胞也被認為是疫苗開發(fā)的候選基質,以人源性細胞制備的登革疫苗候選株還未見報道。因此研究登革病毒在人源性細胞上的適應性對于登革病毒疫苗的研發(fā)具有重要意義。 人二倍體細胞系KMB17取自人胚胎肺組織,為醫(yī)學生物學研究所自建并經衛(wèi)生部批準用于甲型肝炎疫苗的大規(guī)模生產的細胞株.其安全性和細胞穩(wěn)定性都得到了廣泛驗證。 本研究對中緬邊境采集的100份登革熱病人血清樣本進行編號和基本信息登記后,通過登革病毒IgM. IgG抗體檢測試劑盒對血清樣本進行抗體檢測。經過統(tǒng)計和分析,在這些樣本中,Ig M/Ig G陰性的樣本僅占總樣本數的5%,Ig M陽性/Ig G陰性的樣本占總樣本數的26%,而Ig G陽性的樣本所占比例高達69%。樣本接種C6/36細胞擴增后經血凝效價測定,無能夠使新鮮鵝血紅細胞凝集的樣本。由于IgM/Ig G陽性樣本所占比例高達95%,要從中分離活病毒并進行基因分析十分困難。通過與廣東省CDC合作,獲得了Ⅰ-Ⅳ型登革病毒8個中國株,將其分別在C6/36細胞上進行毒種擴增和滴度測定后,以衛(wèi)生部公布的登革病毒通用引物及Ⅰ～Ⅳ型登革病毒型特異性引物通過RT-PCR法進行型別鑒定。經鑒定的毒株以4.0MOI在人胚肺二倍體細胞KMB17上反復傳代,直至登革病毒能在KMB17細胞中引起顯著病變,然后進行培養(yǎng)條件優(yōu)化,確定其最佳感染條件。將病變毒株在KMB17細胞中連續(xù)傳代10代,選育出良好的細胞適應株,并經過三輪噬斑純化。微量滴定法檢測1-10代病毒的感染性滴度,免疫熒光法檢測病毒純化株的抗原性,實時熒光定量法進行增殖動力學研究。病毒培養(yǎng)液經蔗糖梯度離心和超速離心純化后,電鏡檢測病毒顆粒形態(tài)。結果顯示,將Ⅰ～Ⅳ型登革病毒中國株提取RNA進行RT-PCR,能分別擴增出511bp的登革病毒特異性基因和482bp、119bp、290bp和392bp的型特異性基因；毒株接種C6/36細胞收獲擴增的病毒液,將此病毒液感染KMB17細胞并經過反復傳代后,可使KMB17產生明顯的細胞病變(CPE)；將病毒適應株在KMB17細胞上進行10代連續(xù)傳代培養(yǎng),細胞病變速度逐漸增快,至第10代達到增殖高峰。分別經三輪噬斑純化后篩選出四型純化毒株,免疫熒光法檢測感染KMB17細胞的純化株病毒的抗原性,結果均呈陽性,病毒經純化后電鏡下顯示形態(tài)正常增殖動力學研究顯示,登革病毒適應株在KMB17細胞中接種后第3天已經開始增殖,在第5-6天增殖最為迅速,在第7天病毒增殖達到最高峰。本研究選育出了能在KMB17細胞中穩(wěn)定增殖且病毒滴度較高的細胞適應株,為下一步研究登革病毒滅活疫苗和減毒活疫苗奠定基礎。
[Abstract]:dengue virus ( DEN ) belongs to a serological subgroup of the Flaviviridae family of Flaviviridae , which is mainly transmitted through the media insects such as aegypti and aegypti , causing dengue fever ( DF ) as well as dengue hemorrhagic fever ( DHF ) and dengue shock syndrome ( DSS ) with high morbidity and mortality . Especially in recent years , the incidence of dengue fever has increased nearly 30 times worldwide due to global warming and frequent population movements . In the past two years , the number of dengue - infected people has continued to grow . In the central and southern regions of South - East Asia , more than 3 billion people in the United States and the South Pacific region have been threatened and have become world - sex public health problems . So far , the most potential candidate strains of attenuated live vaccine have not yet been reported . Therefore , the adaptability of dengue virus to human - derived cells is of great significance for research and development of dengue virus vaccines .

Human diploid cell line KMB17 is taken from human embryonic lung tissue and is established by the Institute of Medical Biology and approved by the Ministry of Health for large - scale production of hepatitis A vaccine . Its safety and cell stability are widely verified .

In this study , 100 dengue fever human serum samples collected at the Sino - Myanmar border were numbered and registered with basic information , and IgM was detected by dengue virus . In this paper , we have obtained 8 Chinese strains of dengue virus type 鈪，

本文編號：1823750