本文選題：狂犬病 + 沙門氏菌　； 參考：《吉林大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：狂犬病毒G基因能夠表達(dá)分子量為67 kd的由524個(gè)氨基酸組成的糖蛋白,糖蛋白是唯一誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和保護(hù)性免疫應(yīng)答的主要結(jié)構(gòu)蛋白,其免疫作用與全病毒疫苗相當(dāng)。膜外區(qū)決定狂犬病毒糖蛋白的抗原性、組織親嗜性及毒力。它既是有效的保護(hù)性抗原,也能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和刺激細(xì)胞免疫。 熱不穩(wěn)定大腸桿菌腸毒素(LT)由一個(gè)A亞單位和一個(gè)經(jīng)5個(gè)非共價(jià)鍵連接形成的五聚體B亞單位構(gòu)成。研究表明,LTB是一種良好的黏膜免疫佐劑,具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用,當(dāng)與其他抗原共刺激機(jī)體后,LTB可促使機(jī)體產(chǎn)生特異的針對(duì)共刺激抗原的抗體而表現(xiàn)出佐劑活性。 近年來(lái),諸多研究已證實(shí)鼠傷寒沙門氏菌可作為細(xì)菌,病毒,寄生蟲和腫瘤疫苗抗原的理想載體,其所攜帶外源基因能夠高效表達(dá)并能全面激發(fā)機(jī)體的體液與細(xì)胞免疫。因此,以鼠傷寒沙門氏菌為基礎(chǔ)的載體在疫苗研究領(lǐng)域備受國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者的關(guān)注。 本研究利用生物信息學(xué)軟件對(duì)狂犬病毒糖蛋白基因以及熱不穩(wěn)定腸毒素B亞單位基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。從GenBank調(diào)取G和LTB基因序列并根據(jù)Oligo-6設(shè)計(jì)2對(duì)引物,以pMD-G和pMD-LTB為模板,通過PCR的方法分別擴(kuò)增G-linker-片段,-linker-LTB片段,然后又以其PCR產(chǎn)物為模板,采用重疊延伸PCR的方法擴(kuò)增出G-LTB的融合基因,然后將該融合基因經(jīng)T-A連接反應(yīng)連接到pMD18-T克隆載體上。質(zhì)粒pMD-G-LTB和pVAX1、pVAX1-ori載體經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后,將所獲得的G-LTB融合基因和載體經(jīng)T4DNA連接酶連接。經(jīng)PCR、酶切鑒定結(jié)果正確,測(cè)序鑒定表明,外源基因核酸序列沒有發(fā)生變異,和Genbank上公布的基因序列一致。將獲得的重組質(zhì)粒pVAX1-G-LTB和pVAX1-ori-G-LTB轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中,質(zhì)粒提取,轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞中。培養(yǎng)48h后,進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)分析,結(jié)果表明,真核表達(dá)質(zhì)粒在BHK-21中表達(dá)了狂犬病病毒G-LTB融合蛋白。Western blot檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)一條68.8kd左右的目的帶,證明了本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-G-LTB和pVAX 1-ori-G-LTB載體。 為了進(jìn)一步檢測(cè)G-LTB融合基因的免疫原性,將pVAX1, pVAX1-G, pVAX-1-G-LTB, pVAX1-ori-G-LTB電轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌突變株phoP/phoQ中,構(gòu)建的重組株,均以1010 CFU的劑量口服免疫6-8周齡的雌性BALB/C小鼠。間隔10天免疫一次,共免疫兩次�？袢《綢gG抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明phoP/phoQ(pVAX1-G-LTB)和p-hoP/phoQ(pVAX1-ori-G-LTB)免疫組的抗體水平明顯高于控制組。中和抗體檢測(cè)表明抗體水平大于0.5IU/mL,而對(duì)照組和PBS組均低于0.5IU/mL。動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)表明phoP/phoQ(pVAX1-G-LTB)和phoP/phoQ(pVAX1-ori-G-LTB)組分別達(dá)到了50%、60%的保護(hù)率。IL-2水平檢測(cè)結(jié)果同上,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異明顯。本研究結(jié)果表明,以減毒沙門氏菌為載體運(yùn)載G-LTB基因的口服疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗狂犬病毒的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。 同肌肉注射或基因槍等免疫方式相比口服疫苗省時(shí)、方便、價(jià)廉、易于群體免疫,是研制低成本、實(shí)用化口服DNA疫苗的一條新途徑。因此本研究將為進(jìn)一步研發(fā)出基于粘膜免疫途徑的新型狂犬口服疫苗奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The rabies virus G gene is capable of expressing a glycoprotein composed of 524 amino acids having a molecular weight of 67 kd . The glycoprotein is the only major structural protein that induces the body to generate neutralizing antibody and protective immune response . Its immune function is comparable to that of the whole virus vaccine . The outer region of the membrane determines the antigenicity , tissue tropism and virulence of the rabies virus glycoprotein . It is both an effective protective antigen and can induce neutralizing antibody and stimulate cell immunity .


Heat - labile Enterotoxin ( LT ) is composed of a subunit A and a pentamer B subunit formed from five non - covalent bonds . The study shows that LTB is a good mucosal immune adjuvant and has a strong immunomodulatory effect . After co - stimulating the organism with other antigens , LTB can induce specific antibody against costimulatory antigen to show adjuvant activity .


In recent years , many researches have proved that Salmonella typhimurium can be used as an ideal carrier for bacteria , viruses , parasites and tumor vaccine antigens , which carry foreign genes efficiently and completely stimulate body fluid and cellular immunity . Therefore , the carrier based on Salmonella typhimurium has attracted much attention from many scholars in the field of vaccine research .


The fusion gene of G - LTB was amplified by PCR . The fusion gene of G - LTB was amplified by PCR .


In order to further detect the immunogenicity of the G - LTB fusion gene , the recombinant strains were immunized twice with a dose of 1010 CFU for 6 - 8 weeks old female BALB / C mice .


Compared with intramuscular injection or gene gun immunization , it is convenient , cheap and easy to group immunity . It is a new way to develop low - cost and practical oral DNA vaccine .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 程瑋;肖嘯;于恒智;楊美蘭;楊繼生;;狂犬病疫苗研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2007年12期

2 李文建,鄒全明;粘膜免疫佐劑:腸產(chǎn)毒性大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)研究進(jìn)展[J];免疫學(xué)雜志;2000年S1期

3 金寧一,郭志儒,趙懷龍,張茂林;狂犬病毒CTN株糖蛋白重組雞痘病毒與核酸疫苗的聯(lián)合免疫[J];免疫學(xué)雜志;2004年04期

4 張守峰,扈榮良,肖躍強(qiáng),田向陽(yáng),夏咸柱;表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的重組犬2型腺病毒的構(gòu)建[J];中國(guó)病毒學(xué);2005年02期

5 張德禮;狂犬病疫苗的研究動(dòng)向[J];中國(guó)畜禽傳染病;1994年06期

6 鄭學(xué)星;夏咸柱;楊松濤;王化磊;孫培錄;;反向遺傳學(xué)技術(shù)及其在狂犬病病毒研究中的應(yīng)用[J];中國(guó)病原生物學(xué)雜志;2008年08期

7 鄒瑩;狂犬病口服疫苗的研究進(jìn)展[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;1996年11期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前7條

1 于志鳳;狂犬病病毒糖蛋白哺乳動(dòng)物細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系建立及特性研究[D];吉林大學(xué);2006年

2 劉曄;狂犬病病毒糖蛋白—犬2型腺病毒重組疫苗生物安全評(píng)價(jià)及免疫研究[D];吉林大學(xué);2006年

3 黎銘;狂犬病新型口服疫苗—糖蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以及表達(dá)細(xì)菌的篩選[D];廣西大學(xué);2006年

4 李忠;犬2型腺病毒E3區(qū)表達(dá)調(diào)控及狂犬病病毒CVS株糖蛋白重組疫苗研究[D];吉林大學(xué);2006年

5 王玉峰;狂犬病病毒糖蛋白重組偽狂犬病病毒載體構(gòu)建及瞬時(shí)表達(dá)[D];吉林大學(xué);2007年

6 王曉虎;狂犬病病毒熒光抗體病毒中和試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2007年

7 王照;表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的偽狂犬病病毒gG~-基因缺失轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

，

本文編號(hào)：1807170