本文選題：RNA干擾 + 短發(fā)夾RNA��； 參考：《遵義醫(yī)學(xué)院》2011年碩士論文

【摘要】：目的：針對(duì)2型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus type 2, HSV-2) UL54基因構(gòu)建短發(fā)夾RNA (small hairpin RNA, shRNA)表達(dá)載體,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入人胚胎腎293株(Human Embryonic Kidney cells, HEK293)細(xì)胞,在體外細(xì)胞水平上觀察shRNA表達(dá)載體對(duì)HSV-2 UL54基因表達(dá)的影響,以及對(duì)HSV-2在HEK293細(xì)胞中復(fù)制的影響。 方法：針對(duì)HSV-2 UL54基因篩選出5條擬干擾位點(diǎn),構(gòu)建5個(gè)抑制UL54基因的短發(fā)夾RNA的真核表達(dá)載體,分別命名為shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4 shRNA5,以及不針對(duì)任何序列的陰性表達(dá)載體shRNA NC。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,48小時(shí)后再接種HSV-2。采用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測UL54mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,終點(diǎn)滴定法檢測細(xì)胞上清液中的病毒滴度。 結(jié)果：(1)酶切和測序鑒定重組表達(dá)載體shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4、shRNA5、shRNA NC構(gòu)建成功；(2)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示,與空白組(未轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體),shRNA1、shRNA4、shRNA5均不同程度降低UL54 mRNA的表達(dá)水平(P0.05)。(3)終點(diǎn)滴定法結(jié)果顯示shRNA1、shRNA4、shRNA5可不同程度降低上清液中的病毒滴度((P0.05)。 結(jié)論：成功構(gòu)建shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4、shRNA5重組表達(dá)載體,shRNA1、shRNA4、shRNA5能在體外細(xì)胞水平上不同程度的干擾HSV-2 UL54基因表達(dá),抑制HSV-2在HEK293細(xì)胞中復(fù)制,為進(jìn)一步利用RNAi技術(shù)抗HSV-2的研究提供參考數(shù)據(jù)。
[Abstract]:Objective: to construct the expression vector of short hairpin RNA small hairpin RNAs (shRNAs) targeting herpes simplex simplex virus type 2 (HSV-2) UL54 gene and transfer them into human Embryonic Kidney cells (HEK293) cells by liposome transfection. The effect of shRNA expression vector on the expression of HSV-2 UL54 gene and the replication of HSV-2 in HEK293 cells were observed in vitro. Methods: five pseudo interference sites were screened from HSV-2 UL54 gene, and 5 eukaryotic expression vectors of short hairpin RNA were constructed, named shRNA1hRNA2hRNA2hRNA3hRNA4 shRNA5, and negative expression vector shRNA nc. which did not target any sequence. HEK293 cells were transfected with liposome mediated expression vector for 48 hours and then inoculated with HSV 2. The transcriptional level of UL54mRNA was detected by fluorescence quantitative RT-PCR and the titer of virus in supernatant was detected by end-point titration. Results the recombinant expression vector shRNA1, shRNA2, shRNA3, shRNA4, shRNA5, shRNA5, was successfully constructed by restriction endonuclease digestion and sequencing. The results of titration showed that shRNA1shRNA4hRNA5 could decrease the titer of UL54 mRNA in the supernatant to a different extent, compared with the blank group (P 0.05, P 0.05, P 0.05, P 0.05). The results of titration showed that shRNA1shRNA4hRNA5 could decrease the virus titer (P0.05) in the supernatant. Conclusion: the recombinant expression vector of shRNA1hRNA2shRNA2hRNA3hRNA4hRNA4hRNA5 can interfere with the expression of HSV-2 UL54 gene in vitro and inhibit the replication of HSV-2 in HEK293 cells, which provides reference data for further research on anti- by RNAi technique.
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：1793649