本文選題：γδT細(xì)胞 + HA蛋白　； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2011年博士論文

【摘要】：血凝素蛋白(hemagglutinin,HA)是流感病毒表面最主要也是最重要的蛋白,負(fù)責(zé)與宿主受體結(jié)合,主要引起體液免疫應(yīng)答,也能引起固有免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。γδT細(xì)胞是一種表面表達(dá)TCRγδ分子的T細(xì)胞亞群,能被病毒分子快速活化,釋放細(xì)胞因子,殺傷感染細(xì)胞,而產(chǎn)生抗感染的功能。但γδT細(xì)胞對流感病毒的免疫應(yīng)答人們所知甚少,對γδT細(xì)胞與流感病毒最重要的成分HA蛋白相互作用的研究更是空白。因此,我們擬通過研究HA蛋白與γδT細(xì)胞的相互作用及機(jī)制,來加深人們對流感病毒HA引起的免疫反應(yīng)的了解,為了更好的預(yù)防和治療流感感染提供新的策略。這一研究,也為進(jìn)一步探尋γδT細(xì)胞識別的配體的特異性和多樣性、了解γδT細(xì)胞的生物學(xué)功能尤其是抗病毒感染方面的功能奠定基礎(chǔ)。 在本研究中,我們主要關(guān)注以下四個問題。 第一,流感病毒入侵人體時,其表面的HA蛋白能否刺激外周血中的γδT細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答? 第二,如果能產(chǎn)生免疫應(yīng)答,那么免疫應(yīng)答的機(jī)制是怎樣的?HA蛋白能否被γδT細(xì)胞直接識別,受體分子是什么? 第三,如果HA蛋白不能被γδT細(xì)胞直接識別,是否還有其他的作用機(jī)制介導(dǎo)了γδT細(xì)胞對HA蛋白的免疫應(yīng)答作用? 第四,有報(bào)道,活化的γδT細(xì)胞能殺傷病毒感染的宿主細(xì)胞,那么這種殺傷是由什么分子經(jīng)由什么通路介導(dǎo)的? 針對上述四個科學(xué)問題,我們進(jìn)行了以下研究,得到了下述結(jié)果。 (1)利用昆蟲真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)多株重組A型流感病毒HA蛋白,并包裝了外被上述HA蛋白的假病毒顆粒。 (2)利用重組表達(dá)的流感HA蛋白刺激人外周血單個核細(xì)胞(PBMC),檢測發(fā)現(xiàn),能促進(jìn)其中的γδT細(xì)胞表達(dá)早期活化分子CD69等,也能促進(jìn)其活化性細(xì)胞因子IFN-γ等表達(dá)。同樣在假病毒水平,也取得與此一致的結(jié)果。 (3)利用ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal)等多種方法我們發(fā)現(xiàn)HA蛋白能與γδT細(xì)胞結(jié)合。而短肽、蛋白、細(xì)胞水平的多重檢驗(yàn)證明了γδT細(xì)胞上與HA結(jié)合的特異性受體不是TCRγδ。抗體封閉實(shí)驗(yàn)同樣排除了NKG2D、TLRs、NCR等可能的特異性受體分子的結(jié)合作用。最終發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞上結(jié)合HA蛋白的受體是非特異性的α-2,3和α-2,6唾液酸糖苷受體分子。 (4)進(jìn)一步檢測分析發(fā)現(xiàn),HA蛋白和假病毒不能直接活化單一的γδT細(xì)胞,需要其他免疫細(xì)胞的輔佐作用,這種輔佐作用可能是通過HA蛋白刺激PBMC中其他細(xì)胞分泌產(chǎn)生的可溶性分子如細(xì)胞因子等進(jìn)一步誘導(dǎo)了γδT細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。 (5)利用假病毒感染巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)活化的γδT細(xì)胞對其有殺傷活性,且這種殺傷作用可能是通過NKG2D分子識別感染的巨噬細(xì)胞表面表達(dá)上調(diào)的應(yīng)激分子ULBP等介導(dǎo)的。 綜上,A型流感病毒血凝素蛋白能刺激外周血中的γδT細(xì)胞活化,分泌細(xì)胞因子。但是這種活化是一種非直接的的相互作用,需要其他免疫細(xì)胞的輔佐,可能是由其他細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性分子如細(xì)胞因子引起的�；罨摩忙腡細(xì)胞能通過NKG2D分子識別應(yīng)激分子對假病毒感染的靶細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。 上述結(jié)果證明,在流感病毒感染機(jī)體時,γδT細(xì)胞快速參與了機(jī)體的抗感染免疫過程。HA蛋白是這一過程的重要一環(huán),它刺激了γδT細(xì)胞快速活化,產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本研究還初步闡明了在外周血中HA蛋白活化γδT細(xì)胞的作用機(jī)制和在感染部位γδT細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用的作用機(jī)制。對γδT細(xì)胞抗病毒感染免疫的研究做了補(bǔ)充,也啟示我們結(jié)合γδT細(xì)胞對HA蛋白的快速免疫應(yīng)答開發(fā)抗流感病毒尤其是高致病性禽流感病毒治療和預(yù)防的新手段。
[Abstract]:Hemagglutinin (HA) is the most important and most important protein on the surface of the influenza virus. It is responsible for combining with the host receptor, mainly causing the humoral immune response, and also causing the inherent immune response and cellular immune response. The gamma delta T cell is a T cell subgroup of the surface expressing TCR gamma delta, which can be quickly activated by the virus and release. Cytokines, which kill infected cells, produce anti infection functions. But the immune response of T cells to influenza viruses is poorly understood. The study of the interaction between the T cells and the most important component of the influenza virus, HA protein, is more blank. Therefore, we intend to deepen people by studying the interaction and mechanism of HA egg white and gamma delta T cells. Our understanding of the immune response to influenza virus HA provides a new strategy for the prevention and treatment of influenza infection. This study also provides a basis for further exploration of the specificity and diversity of the ligand for the recognition of gamma delta T cells and the understanding of the biological functions of the gamma delta T cells, especially the function of the disease resistant infection.
In this study, we focus on the following four questions.
First, can influenza virus invade the human body, can its surface HA protein stimulate the gamma delta T cells in peripheral blood to produce immune response?
Second, if an immune response is generated, then what is the mechanism of the immune response? Can HA protein be directly recognized by the gamma delta T cell and what is the receptor molecule?
Third, if HA protein can not be directly identified by gamma delta T cells, is there any other mechanism that mediates the immune response of T cells to HA protein?
Fourth, it has been reported that activated gamma delta T cells can kill host cells infected by virus. What pathway is the molecular pathway mediated by this killing molecule?
In view of the above four scientific problems, we carried out the following research and got the following results.
(1) using the insect eukaryotic expression system to express multiple recombinant influenza A virus HA protein and package the fake virus particles which are coated with the above HA protein.
(2) the recombinant expression of influenza HA protein was used to stimulate human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), and it was found that it could promote the expression of the early activation molecule CD69 in the T cells, and also promote the expression of the activated cytokine IFN- gamma. The same results were obtained at the level of the pseudo virus.
(3) we found that using ELISA, flow cytometry, laser confocal scanning microscope (Confocal) and other methods, we found that HA protein can combine with gamma delta T cells. And the multiple tests of short peptide, protein, and cell level prove that the specific receptor on the T cell with HA is not TCR - Delta. The antibody blocking experiment also excludes the possible NKG2D, TLRs, NCR and so on. The binding of specific receptor molecules revealed that the receptor binding to HA protein on gamma delta T cells was nonspecific alpha -2,3 and alpha -2,6 sialoglycoside receptor molecules.
(4) further detection and analysis found that HA protein and pseudo virus can not directly activate a single gamma delta T cell, which requires the adjuvant effect of other immune cells, which may be further induced by HA protein to stimulate the other cells secreted by other cells in PBMC, such as cytokines, such as cytokine, to induce the immune response of the gamma delta T cells.
(5) using a pseudo virus to infect macrophages, it is found that the activated gamma delta T cells have a killing activity, which may be mediated by the NKG2D molecule to identify the up-regulated stress molecule ULBP on the surface of infected macrophages.
To sum up, the A influenza virus hemagglutinin protein can stimulate the activation of the delta T cells in the peripheral blood and secrete cytokine. But this activation is a non direct interaction that requires the adjuvant of other immune cells and may be caused by the soluble molecules produced by other cells, such as cytokine. The activated gamma delta T cells can pass through the NKG2D fraction. Sub identified stress molecules produce lethal effects on target cells infected by false virus.
These results show that when the influenza virus infected the body, the.HA protein of the gamma delta T cells is an important part of this process. It stimulates the rapid activation of the gamma delta T cells and produces the immune response. This study also preliminarily clarified the mechanism of the activation of the HA protein in the peripheral blood and the mechanism of the activation of the T cells in the peripheral blood and the infection part. The mechanism of the killing effect of the bits of gamma delta T cells, supplementing the study of the immune response to the anti-virus infection of the gamma delta T cells, also enlightens us that we combine the rapid immune response of the T cells to the HA protein to develop a new method for the treatment and prevention of the influenza virus, especially the highly pathogenic avian influenza virus.

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

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本文編號：1791894