本文選題：胚胎干細(xì)胞 + PML/RARα基因��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2012年碩士論文

【摘要】：背景：胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)是從囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出來的多潛能干細(xì)胞,具有多向分化能力。病毒攜帶外源基因感染ES細(xì)胞后,通過囊胚注射獲得具有胚系遺傳的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物�？捎么朔椒ǚ治鐾庠椿虻墓δ芗罢{(diào)節(jié)。急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)是髓系白血病的一種,其特異性的細(xì)胞遺傳表現(xiàn)為t(15；17),即15號(hào)和17號(hào)染色體分別斷裂并發(fā)生易位,形成PML/RARa融合基因。PML/RARa融合蛋白阻止細(xì)胞分化,致使骨髓中堆積大量異常早幼粒細(xì)胞。另外,還通過干擾正常PML蛋白的功能促進(jìn)白血病細(xì)胞惡性增殖及壽命延長。因此,建立一個(gè)體內(nèi)模型研究PML/RARa基因?qū)PL的作用機(jī)制是十分重要的。目前,仍缺少一個(gè)可誘導(dǎo)的APL動(dòng)物模型研究此機(jī)制。 目的：建立一個(gè)Tet-on系統(tǒng)調(diào)控的hPML/RARa轉(zhuǎn)基因小鼠模型。利用此模型,研究PML/RARa融合蛋白對(duì)造血干祖細(xì)胞(hematopoietic stem and progenitor cells, HSCs/HPCs)的影響。 方法：我們利用慢病毒載體將人PML/RARa基因(hPML/RARa)導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞中,已獲得攜帶hPML/RARa基因的ES細(xì)胞,且其具有正常核型,同時(shí)通過囊胚注射已形成嵌合體小鼠。病毒載體上含有Tet-on表達(dá)調(diào)控系統(tǒng),可通過強(qiáng)力霉素(doxycycline, dox)誘導(dǎo)hPML/RARa基因表達(dá)。通過集落形成實(shí)驗(yàn)(colony-forming cell, CFC)、長周期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)(long term culture, LTC)、液體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究PML/RARa基因?qū)SCs/HPCs及造血細(xì)胞分化的影響。另外,我們通過體內(nèi)長期誘導(dǎo),利用流式細(xì)胞儀分析監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠白血病發(fā)病進(jìn)程。 結(jié)果：RT-PCR結(jié)果顯示,攜帶hPML/RARa基因的ES細(xì)胞dox誘導(dǎo)24小時(shí)表達(dá)hPML/RARa基因；轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓細(xì)胞dox誘導(dǎo)3天表達(dá)hPML/RARa基因。轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)dox誘導(dǎo)10天后,CFC結(jié)果表明,hPML/RARa基因表達(dá)增加了HPCs數(shù)量,同時(shí)促進(jìn)其向粒系分化。體外液體培養(yǎng)結(jié)果也顯示hPML/RARa基因表達(dá)促進(jìn)造血細(xì)胞向粒系方向分化。另外,轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)長期誘導(dǎo)8月后仍具有正常表型。 結(jié)論：1.我們成功建立了一個(gè)dox誘導(dǎo)hPML/RARa基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。2.PML/RARa基因表達(dá)增加HPCs數(shù)量,促進(jìn)造血細(xì)胞向粒系分化。3.長期dox誘導(dǎo)8月后,轉(zhuǎn)基因小鼠還未發(fā)生APL表型,表明APL的發(fā)生可能需要更長時(shí)間或二次及多次打擊。
[Abstract]:Background: embryonic stem cells (ESCs) are multipotent stem cells isolated from blastocysts. Transgenic animals with embryogenic inheritance were obtained by blastocyst injection after infection of es cells with foreign genes. This method can be used to analyze the function and regulation of exogenous genes. Acute promyelocytic leukemia (promyelocytic) is a kind of myeloid leukemia. Its specific cell genetic manifestation is tnl 15N 17, I. e., chromosome 15 and chromosome 17 are broken and translocated, respectively, to form PML/RARa fusion gene. PML / Rara fusion protein prevents cell differentiation. Causes the bone marrow to accumulate the massive abnormal promyelocyte. In addition, the malignant proliferation and longevity of leukemic cells were increased by interfering with the function of normal PML protein. Therefore, it is very important to establish an in vivo model to study the mechanism of PML/RARa gene acting on APL. At present, there is still a lack of an inducible APL animal model to study this mechanism. Objective: to establish a hPML/RARa transgenic mouse model regulated by Tet-on system. Using this model, the effect of PML/RARa fusion protein on hematopoietic stem and progenitor cells (HSCs / HPCs) was studied. Methods: human PML/RARa gene hPMLR Raa was introduced into mouse es cells by lentivirus vector. Es cells carrying hPML/RARa gene were obtained and had normal karyotype, and chimeric mice were formed by blastocyst injection. The expression of hPML/RARa gene was induced by doxycycline (dox) and doxycycline (Doxycycline). The effects of PML/RARa gene on HSCs/HPCs and hematopoietic cell differentiation were studied by colony forming assay (CFC), long term culture (LTC) and liquid culture. In addition, long-term induction in vivo and flow cytometry were used to monitor the pathogenesis of leukemia in transgenic mice. Results the expression of hPML/RARa gene was induced by dox of es cells carrying hPML/RARa gene at 24 hours and the expression of hPML/RARa gene was induced by dox in bone marrow cells of transgenic mice for 3 days. After 10 days of dox induction in transgenic mice, the results showed that the expression of hPML / RARa gene increased the number of HPCs and promoted its differentiation into granulocytes. Liquid culture in vitro also showed that hPML/RARa gene expression promoted hematopoietic cells to granulocyte differentiation. In addition, transgenic mice still have normal phenotype after long-term induction in vivo. Conclusion 1. We successfully established a transgenic mouse model of hPML/RARa gene expression induced by dox. 2. PML / Rara gene expression increased the number of HPCs and promoted hematopoietic cells to differentiate into granulocytes. After long term dox induction for 8 months, no APL phenotype was found in transgenic mice, indicating that APL may take longer, twice or more blows.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R-332;R733.7

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7 陳

本文編號(hào)：1790276