本文選題：樹突狀細胞 + 活化后凋亡　； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2011年博士論文

【摘要】：活化后凋亡(activation-induced cell death, AICD)是淋巴細胞受到外來或自身抗原刺激后發(fā)生活化、增殖,并行使免疫功能后多數細胞的最終歸宿,也是免疫系統(tǒng)負向調控的重要環(huán)節(jié),有利于控制免疫應答的強度和維持免疫耐受。但是活化后凋亡的淋巴細胞如何誘導免疫負向調控還有許多未知之處。多項研究提示正常機體中靜息的自體細胞凋亡后,會被巨噬細胞或樹突狀細胞(dendritic cell, DC)迅速吞噬和清除,并誘導免疫耐受,且這一過程的缺陷與多種疾病的病因相關。活化后凋亡淋巴細胞被清除的過程和對巨噬細胞或樹突狀細胞的影響尚不清楚。 近年來研究發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞中具有不同功能的亞群,能夠正向或負向調控免疫應答。而不同DC亞群可以吞噬處理凋亡細胞產生不同的生理效應,能夠誘導免疫耐受,也可促進免疫應答。前期研究顯示,吞噬自體靜息凋亡細胞的樹突狀細胞能夠抑制免疫反應,并可能有如下機制參與其中。吞噬凋亡細胞使樹突狀細胞促炎性細胞因子分泌減少,而某些抑制性細胞因子釋放增多,如IL-10、TGF-β、IDO等;吞噬凋亡細胞的樹突狀細胞可以誘導調節(jié)性T細胞(regulatory T cells, Treg)的產生,通過Treg來負向調控免疫反應。DC吞噬凋亡細胞后產生免疫抑制的機制目前多處于爭論之中。不同的模型可能會出現(xiàn)不同的效應。我們研究組前期采用脾臟基質細胞、腦小膠質細胞和肝基質細胞誘導DC分化形成DCreg,能夠顯著抑制免疫反應,其主要的抑制機制是分泌NO,并且發(fā)現(xiàn)NO對T細胞的增殖具有直接抑制作用。因此,我們采用GM-CSF/IL4體外培養(yǎng)的小鼠樹突狀細胞和經抗原刺激后發(fā)生凋亡的CD4+ T細胞為模型展開研究,旨在(一)探討在免疫應答過程中,吞噬活化后凋亡淋巴細胞的DC是否能夠形成調節(jié)性DC,對免疫應答產生負向調控作用;(二)這種吞噬凋亡細胞的DC是否分泌NO,其濃度是否能夠對T細胞活化、增殖及功能產生抑制效應,以及DC產生NO的機制,。 我們用體外培養(yǎng)的成熟的C57BL/6小鼠骨髓樹突狀細胞作為提呈細胞,在OVA323 339多肽存在的情況下,刺激經磁珠分離純化的TCR轉基因CD4+ T細胞(DO11.10×C57BL/6 F1小鼠)。CD4+ T細胞活化后約96小時,即有大量細胞出現(xiàn)活化后凋亡。我們采用熒光染色,流式細胞檢測和透射電鏡等方法驗證了CD4+ T細胞的凋亡。將DC與凋亡細胞共培養(yǎng)72小時以上,獲得吞噬凋亡細胞的DC(DCapo),并采用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡來證實DC對凋亡細胞和凋亡小體的吞噬作用。用流式細胞分析對mDC和DCapo進行表型和吞噬功能的比較發(fā)現(xiàn),經凋亡淋巴細胞處理后,DCapo的CD11c、MHC II類分子和CD40、CD80、CD86共刺激分子的表達明顯下降,而CD11b的表達上升。細胞的吞噬功能也增強,與不成熟的樹突狀細胞類似。以上結果顯示,DC在體外能夠吞噬活化后凋亡的淋巴細胞,其生物學特性會發(fā)生顯著變化。 我們在體外采用抗原提呈系統(tǒng)來評價DCapo的抗原提呈功能及是否具有免疫抑制效應。在mDC刺激特異性CD4+或CD8+ T細胞的實驗中,加入DCapo,用流式細胞術分別檢測T細胞的數量和CFSE分裂峰,評價CD4+或CD8+ T細胞的活化和增殖情況。結果顯示mDC能夠顯著刺激T細胞的增殖和分裂,而DCapo本身刺激T細胞增殖分裂的能力則很弱。DCapo能夠顯著抑制mDC刺激引起的的CD4+和CD8+ T細胞的增殖和分裂。我們將新鮮MACS分選的帶有OVA特異性CD4+或CD8+ T細胞過繼性回輸到受體小鼠體內,然后再回輸已經荷載抗原肽的mDC和/或DCapo刺激其增殖,觀察DCapo在體內對抗原特異性免疫反應的作用。在回輸3-4天后用流式細胞術檢測外周血和脾臟抗原特異性T細胞的數量和CFSE分裂峰,結果與體外實驗類似,DCapo在體內也表現(xiàn)為對CD4+和CD8+ T細胞增殖的強烈抑制作用。 然后,我們探討了DCapo發(fā)揮免疫抑制作用的機制。我們檢測發(fā)現(xiàn),吞噬了凋亡淋巴細胞的DC分泌大量的NO。先前的研究證實NO可以直接抑制CD4+ T細胞的增殖效應。我們在體外DCapo抑制mDC刺激抗原特異性的CD4+ T細胞的增殖分裂的實驗體系中,分別加用NO供體(NOC-18)和NO拮抗劑(PBIT),培養(yǎng)4天后用流式細胞術檢測T細胞的數量。發(fā)現(xiàn)在mDC刺激T細胞增殖組加用NO供體后能夠顯著抑制T細胞的增殖分裂。而在DCapo抑制mDC刺激T細胞增殖組中添加NO拮抗劑,DCapo對T細胞增殖的抑制作用能得到很大程度的逆轉。這一結果說明NO在DCapo的免疫抑制作用中發(fā)揮了重要作用。DCapo可以通過NO直接抑制T細胞反應,但是DCapo是否還誘導Treg來間接抑制T細胞反應呢?為了分析DCapo的抑制作用是否與Treg有關,我們利用同時有Foxp3EGFP和DO11.10特異性TCR的雜交一代小鼠T細胞,來替換體外DCapo抑制mDC刺激的抗原特異性T細胞增殖反應實驗中的抗原特異性T細胞,觀察體外DCapo是否可以促進Foxp3EGFPCD4+ T細胞的增加或Treg參與其抑制作用。采用流式細胞術檢測各組中CD4+CD25+Foxp3+細胞比例的變化,結果顯示各實驗組間Treg比例并沒有顯著性差異。進一步的體內實驗發(fā)現(xiàn),活化后凋亡細胞、DCapo體內回輸與PBS對照組間小鼠外周血的CD4+CD25+Foxp3+細胞比例也沒有顯著增加。結果表明,抗原信號誘導的T細胞活化后死亡所誘發(fā)的調節(jié)性DC的免疫抑制作用不是通過誘導Treg來產生的。 既然DCapo能夠通過NO來發(fā)揮直接抑制免疫反應的作用,那么DCapo是如何產生NO的呢?與凋亡細胞的作用是否有關呢?細胞凋亡的早期就有磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)暴露在細胞膜表面,是樹突狀細胞識別凋亡細胞的重要分子。研究提示凋亡細胞膜表面的PS與DC表面的受體結合后可以激活STAT3信號轉導途徑。而STAT3不僅是胞內的信號轉導分子,同時也是轉錄激活因子。多項研究結果顯示在正常細胞或腫瘤細胞,STAT3的激活可以促進多種細胞因子分泌和細胞表面分子的表達,包括IL-6, IL-10, TGF-β等等。這些細胞因子常常與DC的負向調控功能有關。而STAT3的活化是否和NO的釋放有關目前尚不明確。 我們的研究結果表明,經抗原信號刺激產生的凋亡T細胞能誘導DC細胞分泌NO,而NO是DCapo發(fā)揮免疫抑制效應的重要分子。因此我們試圖分析活化后凋亡的淋巴細胞是否也能夠使DC胞內的STAT3磷酸化,其活化是否與NO的生成有直接關系。我們采用Western Blot的方法對DCapo胞內的STAT3信號分子進行了蛋白檢測,結果發(fā)現(xiàn)隨著與凋亡細胞共培養(yǎng)時間的延長,DCapo胞內p-STAT3的表達也隨之增強,從而增強了STAT3的轉錄活性。隨著共培養(yǎng)時間的延長,iNOS的表達也逐漸上升,其趨勢與p-STAT3一致,而且iNOS的蛋白表達水平和mRNA轉錄水平均可以被特異性p-STAT3抑制劑JSI-124所抑制。對DCapo分泌NO的檢測也證實,JSI-124有抑制DCapo分泌NO的作用。以上結果說明活化后凋亡淋巴細胞對DCapo的誘導與DC胞內的STAT3信號通路相關,STAT3的磷酸化與iNOS的產生有很強的相關性。 本課題研究發(fā)現(xiàn),將活化后凋亡的淋巴細胞與DC細胞共培養(yǎng)能夠誘導出調節(jié)性DC(DCapo),其CD11c、MHC II類分子和共刺激分子的表達明顯下降,CD11b的表達上升,吞噬功能增強,同時能夠顯著抑制抗原特異性T細胞的增殖和分裂,符合調節(jié)性樹突狀細胞的特點;DCapo主要通過分泌NO來抑制抗原特異性T細胞的增殖,未能發(fā)現(xiàn)DCapo誘導Treg的產生或Treg參與DCapo的抑制作用;活化后凋亡淋巴細胞誘導DCapo的分子機制與STAT3信號轉導途徑的活化相關,并且STAT3的活化導致iNOS的轉錄增強,使的NO的分泌增加,NO直接參與了DCapo的免疫抑制機制。這些結果證實吞噬了活化后凋亡淋巴細胞的樹突狀細胞是一群具有免疫抑制表型和功能的調節(jié)性DC細胞,NO是其發(fā)揮免疫抑制作用的重要分子,活化后凋亡淋巴細胞誘導的DCapo胞內STAT3活化與iNOS的合成和NO分泌相關。我們研究的結果進一步闡明了活化后凋亡淋巴細胞對樹突狀細胞的作用,并有助于解釋了活化后凋亡誘導免疫耐受的機制。
[Abstract]:Activation - induced cell death ( AICD ) is an important link in the activation , proliferation and immune tolerance of lymphocytes after activation and proliferation .

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本文編號：1777922