本文選題：Synaptotagminl + 小鼠卵母細胞減數(shù)分裂��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：Synaptotagmin1(Syt1)作為鈣離子感受器,與SNAP-25,syntaxin和synaptobrevin一起構(gòu)成7S或者所謂的SNARE蛋白復(fù)合體,用于調(diào)節(jié)神經(jīng)末梢胞膜與神經(jīng)突觸囊泡的錨定和融合,引起胞內(nèi)鈣離子濃度升高誘導(dǎo)神經(jīng)囊泡內(nèi)神經(jīng)顆粒的胞吐發(fā)生。Syts是由一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的家族蛋白組成,從脊椎動物到人類高度保守于各類組織中。Syt1和Syt2在神經(jīng)組織豐富表達,尤其Syt1在神經(jīng)和分泌囊泡膜富集,在外源刺激作用下,結(jié)合胞內(nèi)鈣離子誘導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)和分泌顆粒的胞吐。但是到目前為止,關(guān)于Syt1在生殖細胞中的功能研究很少,尤其與卵母細胞骨架相關(guān)。本課題中,我們深入地研究了Syt1在小鼠卵母細胞發(fā)育過程中的亞細胞定位及可能發(fā)揮的作用。免疫熒光標記證明Syt1定位主要集中分布在MⅠ和MⅡ期紡錘體的兩極,這些可能與Syt1在小鼠卵母細胞成熟過程中所行使的功能有關(guān),并且證實了Syt1在MⅠ和MⅡ期與中心體相關(guān)蛋白y-tubulin共定位。另外在卵母細胞各時期集中于皮質(zhì)區(qū)、部分分散于胞漿,在MⅠ和MⅡ期皮質(zhì)區(qū)有1/3靠近染色體的無定位區(qū)域(類似于卵母細胞皮質(zhì)顆粒的分布特征),此亞細胞定位可能與Sytl對小鼠卵母細胞皮質(zhì)顆粒的胞吐和受精功能有關(guān)(數(shù)據(jù)未列出)。紫杉醇處理卵母細胞后發(fā)現(xiàn)上述Sytl的定位與紡綞體的組裝相關(guān)。紫杉醇試驗后微管高度集中,在胞內(nèi)產(chǎn)生很多星體,免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)Syt1集中定位于星體和高度集中的微管兩極。在小鼠卵母細胞內(nèi)注射Syt1特定寡聚核苷酸(morpholino),它能與Syt1的mRNA或(和)DNA結(jié)合,特異性抑制其轉(zhuǎn)錄或(和)翻譯,降調(diào)其表達水平,注射前后免疫印跡試驗證實了這一點。降調(diào)Syt1表達后,我們發(fā)現(xiàn)紡綞體組裝異常比例升高,且多數(shù)為無極、單極或者多極紡綞體,其次有拉長紡錘體和形態(tài)各異紡錘體；染色體排列異常；第一極體排出率下降,并影響微管組織中心相關(guān)蛋白γ-tubulin的正確定位。另外小鼠卵母細胞減數(shù)分裂進程受到阻礙,染色體鋪片和紡錘體檢驗點蛋白試驗發(fā)現(xiàn)Syt1降調(diào)后后期染色體相對于對照組染色體未能完成正確分離并激活了后期紡錘體檢驗點蛋白的活性,說明Sytl對小鼠卵母細胞減數(shù)分裂中后期轉(zhuǎn)換進程起著重要的作用。為了進一步深入研究降調(diào)Sytl后引起的卵母細胞及其對分裂成熟進程影響的缺陷,‘我們向卵母細胞內(nèi)注射了β5-tubulin-GFP mRNA, H2B-RFP mRNA和Syt1-MO的混合物,并應(yīng)用活細胞工作站延時拍攝系統(tǒng)去捕捉紡綞體、染色體和卵母細胞分裂進程在降調(diào)了Syt1后的的動態(tài)變化。結(jié)果證實了降調(diào)Sytl會影響卵母細胞紡綞體的遷移,紡綞體極的形成和穩(wěn)定；染色體阻滯在第一次分裂前中期或者中期(Pro-MI/MI);形態(tài)異常的紡錘體不能發(fā)揮正常功能,使染色體不能沿微管正常排列,導(dǎo)致卵母細胞不能完成中后期轉(zhuǎn)換且反復(fù)分離失敗和第一極體不能釋放�？傊�,實驗結(jié)果表明：Syt1在卵母細胞減數(shù)分裂成熟的不同階段有不同的特異性定位,其定位主要集中分布在MⅠ和MⅡ期紡錘體的兩極,這些可能與Syt1在紡錘體的組裝和穩(wěn)定、染色體的排列、減數(shù)分裂中后期轉(zhuǎn)換和第一極體釋放的作用有關(guān),它可能作為一種微管組織中心蛋白監(jiān)控紡錘體狀態(tài)或者調(diào)控與紡錘體組裝和穩(wěn)定相關(guān)的蛋白；Syt1參與調(diào)控卵母細胞的減數(shù)分裂中第一次分裂中后期轉(zhuǎn)換和第一極體的釋放。另外在卵母細胞各時期集中于皮質(zhì)區(qū)、部分分散于胞漿,而且在MⅠ和MⅡ期皮質(zhì)區(qū)有1/3靠近染色體的無定位區(qū)域。這些亞細胞定位可能與Syt1對小鼠卵母細胞皮質(zhì)顆粒的胞吐和受精功能有關(guān)(數(shù)據(jù)未列出)。本研究分兩部分進行： [目的] 確定Syt1對小鼠卵母細胞紡綞體組裝和穩(wěn)定的影響。 [研究方法] 卵子的收集和培養(yǎng) 本實驗采用4-6周齡ICR品系雌性小鼠,斷頸法快速處死小鼠后取出卵巢,盛于一次性培養(yǎng)皿中,用刀片將卵巢剁碎,釋放出來停留在第一次減數(shù)分裂間期的未成熟卵母細胞。只將處于GV期的未成熟卵母細胞轉(zhuǎn)移至M2培養(yǎng)滴中,清洗5-6次后,移至覆蓋有礦物油的M16培養(yǎng)滴或者含有2.5gMmilrinone的M16培養(yǎng)滴,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃,5%C02,95%濕度)。培養(yǎng)到不同時期后取出用于免疫印跡、免疫熒光及藥物處理。 Taxol處理卵子 用M16培養(yǎng)液稀釋Taxol至10μmol/ml,待卵子發(fā)育至特定時期后,移至含Taxol的M16培養(yǎng)滴,于培養(yǎng)箱中孵育45分鐘,之后,將卵母細胞徹底洗凈用于免疫熒光實驗。對照組中卵母細胞用相同濃度的DMSO進行處理。 免疫熒光及激光共聚焦顯微鏡檢測 卵母細胞放入含4%多聚甲醛的PBS中室溫30分鐘。在室溫下0.5%TritonX-100透膜20分鐘,卵母細胞采用添加1%BSA的PBS室溫封閉1小時,然后加入1：200的兔抗Syt1抗體,1：200的兔抗y-tubulin抗體,1：200兔抗a-tubulin抗體或1：100anti-a-tubulin-FITC抗體放入4℃冰箱過夜。第二天采用含0.1%Tween20和0.01%Triton X-100的PBS中洗三次,每次5分鐘。卵母細胞在室溫下標記上1：100的FITC/TRICT/CY5羊抗兔IgG,或1：100的FITC/TRICT/CY5羊抗鼠IgG1小時。之后采用Hochest或PI標記8-15分鐘,再洗滌三次。最后卵母細胞移到載玻片上采用激光共聚焦掃描顯微鏡(Zeiss LSM510或者Zeiss LSM710META)檢測。每組實驗最少重復(fù)三次,每組至少檢測50個卵母細胞。 免疫印跡 收集待檢測的卵子約200個,加入等體積2×SDS loading buffer置于沸水中5分鐘,冰上冷卻后瞬時離心,存于冰上或-20℃。微量加樣器上樣,恒壓90V電泳至樣品位于濃縮膠邊緣,改為恒壓120V電泳2.5小時；4℃條件下轉(zhuǎn)膜,恒流200mA2.5小時,蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜；TBS(20mM Tris,137mM NaCl,pH7.4)清洗膜三次,每次10分鐘；膜轉(zhuǎn)至封閉液中(5%脫脂奶粉/TBST)室溫放置1.5小時；TBST (l0mM Tris,150mMNaCl,0.05%Tween20, pH7.5)清洗三次,每次10分鐘；膜移至封閉液稀釋的一抗中4℃放置過夜；TBST清洗三次,每次10分鐘；膜移至封閉液稀釋的二抗中37℃放置1小時；TBST清洗三次,每次10分鐘；SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate kit (Thermo)檢測信號。重復(fù)標記時,膜移至洗脫液(p-mercaptoethanol14.3M,2%SDS,62.5mM Tris, pH6.7)中50。C放置30分鐘,依照上述方法重新與相應(yīng)的一抗、二抗孵育。本實驗涉及到的抗體采用效價如下：兔抗Syt1：1000,鼠抗(3-actin1：1000,抗鼠IgG1：1000。 Morpholino注射 Morpholino是經(jīng)過修飾的人工合成反義寡核苷酸鏈小分子,與目的基因的mRNA或／和DNA結(jié)合,特異性抑制基因的轉(zhuǎn)錄或／和翻譯,可作為研究基因功能的小分子工具。本實驗所用morpholino購自GENE TOOLS公司Sytl-morpholino序列信息如下：5'-GACTGGCACTCACCATTTTTGGTTC-31; Control-morpholino序列信息如下：5'-CCTCTTACCTCAgTTACAATTT ATA-3。用Sigma水稀釋成儲存濃度為2mmM和4mM。注射5-10pl的1mM MO后卵母細胞在含2.5μM的Milrinone中培養(yǎng)24小時。新鮮M2培養(yǎng)液中洗5遍,移到新鮮M16培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)8小時和12小時,收集這兩個時段的卵母細胞固定后做熒光免疫共聚焦試驗。 [結(jié)果] 小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中Syt1的表達和亞細胞定位 體外培養(yǎng)小鼠卵母細胞0小時、2小時、4小時、8小時、10小時和12小時分別對應(yīng)其發(fā)育階段的GV、GVBD、Pro-MI、MⅠ、AⅠ和MⅡ期,用免疫印跡法半定量檢測GV、MⅠ和MⅡ期的蛋白表達水平。結(jié)果顯示在小鼠卵母細胞發(fā)育各時期均有Syt1的表達。為了檢測Sytl在小鼠卵母細胞發(fā)育不同時期的亞細胞定位我們采用了免疫熒光法。Syt1主要集中分布在皮質(zhì)區(qū),部分散在分布于胞質(zhì),尤其從Pro-MI到MⅡ期的卵母細胞,染色體靠近的1/3皮質(zhì)區(qū)域沒有Syt1的熒光信號。上述分布特點類似卵母細胞皮質(zhì)顆粒的分布。到了減數(shù)分裂中期(MⅠ)和(MⅡ),可以明顯地看到Syt1主要聚集在紡綞體的兩極。Syt1定位于小鼠卵母細胞紡綞體兩極現(xiàn)象使得我們思考：是否Syt1與其它的中心體相關(guān)蛋白如γ-tubulin有共定位?我們的研究表明在MⅠ和MⅡ期,Syt`的信號與γ-tubulin相重疊,進一步證實了Sytl在兩極定位的現(xiàn)象。 紫杉醇處理后Sytl的定位 我們用了微管聚集藥物紫杉醇處理小鼠MⅠ期卵母細胞,以明確Syt1與微管動力的關(guān)系。當(dāng)把10μmol/ml的紫杉醇加入培養(yǎng)液處理45分鐘,可以發(fā)現(xiàn)紡綞體微管高度聚集并在胞內(nèi)形成大量星體,Syt1的定位也發(fā)生了變化,集中定位于聚集的微管兩極和星體上,說明Syt1參與微管紡錘體的組裝。 降調(diào)Sytl對MⅠ期和MⅡ期紡綞體組裝和染色體排列的影響 為了進一步明確Syt1在小鼠卵母細胞發(fā)育過程中的作用,我們采用Syt的特異性反義寡核苷酸MO注射。免疫印跡圖顯示MO注射后,Syt1表達水平明顯下降。GV期的卵母細胞注射MO后在含有2.5mM的米力儂的M2培養(yǎng)液中抑制24小時,然后釋放,轉(zhuǎn)移到M16培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng),8小時和12小時后收集MⅠ和MⅡ期卵子。在Syt1-MO注射組,卵母細胞出現(xiàn)了各種形態(tài)異常的紡綞體和排列紊亂的染色體。異常紡錘體主要是極體異常的紡綞體,包括無極、單極、多極；其他異常的類型有拉長和未組裝好的紡綞體。染色體異常主要表現(xiàn)為延遲分離和完全排列紊亂。Syt1-MO注射組卵母細胞紡錘體和染色體異常率分別為79.23%和63.90%(n=130),顯著高于對照組,χ2值分別為70.594和34.507,P值均為0.000。 降調(diào)Syt`的表達導(dǎo)致γ-tubulin從紡綞體的兩極脫落 從上面結(jié)果我們可以推斷Sytl參與了紡綞體組裝和極的聚集。我們以前的研究表明,在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂中,中心體蛋白γ-tubulin,是微管組裝和紡綞體形成的重要調(diào)節(jié)因子。通過MO注射降調(diào)Syt1的表達,我們發(fā)現(xiàn)γ-tubulin的定位也受到了影響,均從紡綞體的兩極脫落下來,散落在綞綞體微管上或胞漿中。 [結(jié)論] 在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中,Sytl參與了微管的組裝,進而影響到染色體排列,并且可能是作為一種微管組織中心相關(guān)蛋白,與其它中心體相關(guān)蛋白相互作用共同調(diào)節(jié)紡綞體的組裝。 [目的] 確定Sytl對小鼠卵母細胞第一次減數(shù)分裂中后期轉(zhuǎn)換及其第一極體釋放的影響。 [研究方法] 卵子的收集和培養(yǎng)、免疫熒光及激光共聚焦顯微鏡檢測與第一部分相同。染色體鋪片 室溫下,卵母細胞在1%檸檬酸鈉溶液中放置10分鐘后,固定在甲醇和冰醋酸3：1新配置的溶液中,之后10mg/ml PI用于染色體染色。封片后置于共聚焦顯微鏡下觀察。Morpholino和β5-tubulin-GFP mRNA、H2B-RFP mRNA聯(lián)合注射Morpholino是經(jīng)過修飾的人工合成反義寡核苷酸鏈小分子,Syt1-morpholino序列信息如下：5'-GACTGGCACTCACCATTTTTGGTTC-3';Control-morpholino序列信息如下：5'-CCTCTTACCTCAgTTACAATTT ATA-3'。用Sigma水稀釋。通過注射5-10pl的2mmM MO和同體積的β5-tubulin-GFP mRNA和H2B-RFP mRNA的混和物。然后卵母細胞在含2.5μM的Milrinone中孵育24小時。新鮮M2培養(yǎng)液中洗5遍,置于新鮮M16培養(yǎng)液培養(yǎng)約2-3小時移入至含有10nMHoechst33342的M16培養(yǎng)液中放到活細胞工作站繼續(xù)培養(yǎng)14-15小時左右,并實時動態(tài)觀察其變化。注射過程中GV期卵子均置于2.5μMmilrinone-M2培養(yǎng)基中,30分鐘內(nèi)完成操作 卵母細胞的活細胞動態(tài)觀察試驗 為了追蹤紡綞體、染色體和卵母細胞減數(shù)分裂進程在降調(diào)了Sytl的卵母細胞內(nèi)的動態(tài)變化,我們向卵母細胞中注射β5-tubulin-GFP mRNA、H2B-RFP mRNA和Syt1MO混合物,每個卵母細胞大約注射10pL。經(jīng)注射的卵母細胞培養(yǎng)至GVBD后放置Perkin Elmer precisely Ultra VIEW VOX活細胞共聚焦成像系統(tǒng),繼續(xù)培養(yǎng)14-15小時左右。我們使用了窄帶通濾波器和一個綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白30%的削減中性密度日色度過濾器。根據(jù)tubulin-GFP和H2B-RFP的熒光強度,曝光時間在300毫秒到800毫秒之間。用IP Lab(Scanalytics)或AQM6(Andor/Kinetic-imaging)的軟件系統(tǒng)支持數(shù)字化的延時成像技術(shù)。 [結(jié)果] 降調(diào)Sytl導(dǎo)致小鼠卵母細胞第一次減數(shù)分裂前中期/中期阻滯、極體排出率降低 GV期卵母細胞注射MO后在含有2.5mmM的米力儂的M2培養(yǎng)液中抑制24小時,然后釋放,轉(zhuǎn)移到M16培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng),10小時或者12小時后收集AI或者MⅡ期卵子。10小時收集的卵母細胞中,激光共聚焦纖維鏡觀察發(fā)現(xiàn)Sytl MO組的卵母細胞大多阻滯在第一次減數(shù)分裂前中期或者中期,然而在對照組中卵母細胞已進入第一次減數(shù)分裂后期。Syt1-MO注射組Pro-MI/MI阻滯率為(91.80%,n=49),較對照MO注射組(31.48%,n=54)顯著增加(χ2=39.055,P=0.000)。另外,12小時收集的卵母細胞中,Syt1-MO注射組極體排除率(45.33%,n=154)與對照組相比差異有顯著性(60.76%,n=161,χ2=7.515,P=0.007)。 降調(diào)Syt`阻礙了染色體分離,并激活紡錘體檢驗點活性 降調(diào)Syt1后影響了小鼠卵母細胞同源染色體的分離及其紡錘體的異�，F(xiàn)象促使我們考慮,進一步證實Syt1-MO降調(diào)影響到小鼠卵母細胞阻滯在Pro-MI/MI期。我們進行了染色體鋪片實驗驗證染色體是否成功分離。如前所述,卵母細胞經(jīng)Syt1-MO和control-MO注射后繼續(xù)培養(yǎng)10小時,固定鋪片后激光共聚焦顯微鏡觀察,結(jié)果表明,Syt1-MO注射組,染色體仍處于未分離狀態(tài)(10/10),相比較而言,對照組中大部分染色體已分離,表明染色體已進入后期完成階段(9/10)。降調(diào)Syt`阻礙染色體的分離現(xiàn)象,使得我們考慮,降調(diào)后是否激活了紡錘體檢驗點(SAC)的活性而引起,Bub3是SAC的一個重要組成成分,所以我們熒光定位檢驗點蛋白Bub3的表達,結(jié)果表明,Syt1-MO組ProMI/MI阻滯卵母細胞檢測到Bub3的特異性信號,而對照組并沒有發(fā)現(xiàn)這種特異性信號。這些數(shù)據(jù)表明Syt1降調(diào)后紡錘體檢驗點活性被激活。 降調(diào)Syt`干擾小鼠卵母細胞的第一次減數(shù)分裂中后期轉(zhuǎn)換 為了進一步深入研究降調(diào)Syt1后引起的卵母細胞成熟障礙,我們向卵母細胞內(nèi)注射了(35-tubulin-GFP mRNA、H2B-RFP mRNA和Syt1-MO或control-MO的混合物,并應(yīng)用了活細胞工作站延時拍攝系統(tǒng)去捕捉紡綞體和染色體的動態(tài)變化。其中p5-tubulin-GFP mRNA和H2B-RFP mRNA分別用于觀察紡錘體和染色體。注射卵母細胞釋放后在M16培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)約4-5小時移至活細胞工作系統(tǒng)觀察。 結(jié)果顯示,在對照組中可觀察到紡錘體約GVBD后2小時開始形成,之后清晰標準的雙極紡錘體慢慢遷移到卵母細胞皮質(zhì)區(qū),然后發(fā)生中后期時期的轉(zhuǎn)換,約觀察7小時第一極體釋放。而且我們觀察了約40個對照組卵母細胞,幾乎所有細胞在不同的減數(shù)分裂時期均呈現(xiàn)出對應(yīng)各時期的正常形態(tài)紡錘體和排列正常的染色體,大部分均能完成第一極體釋放。然而,在Syt1-MO注射組卵母細胞出現(xiàn)各種形態(tài)異常的紡錘體,直至13小時染色體仍不能正確分離且阻滯在Pro-MI/MI時期,之后約14小時染色體和紡錘體均出現(xiàn)紊亂分散在胞內(nèi),且部分染色體脫離紡錘體,接著出現(xiàn)異常的紡錘體和染色體重新聚合又分離現(xiàn)象,直至最后仍無第一極體出現(xiàn)。我們觀察了約30個Syt1-MO注射卵母細胞,幾乎所有細胞均出現(xiàn)了類似上述現(xiàn)象,只有兩個卵母細胞出現(xiàn)第一極體釋放,另外在觀察過程中,幾個細胞死亡 [結(jié)論] Syt1參與調(diào)控卵母細胞的減數(shù)分裂中第一次分裂中后期轉(zhuǎn)換和第一極體的釋放。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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