本文選題：漢坦病毒 + 基因變異��； 參考：《武漢大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：目的： 近十年來我國腎綜合征出血熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)的疫情發(fā)生了明顯的變化,湖北地區(qū)作為HFRS的重疫區(qū)之一,流行變化的原因仍不明了,宿主及病毒自身的改變與其關(guān)系密切�；诖�,本研究擬從漢坦病毒(Hantavirus, HV)及其不同宿主兩方面開展研究,對湖北地區(qū)HV流行株的基因變異與進化特征和自然宿主與終宿主的基因特征、感染與分布情況進行全面分析,以了解湖北地區(qū)2000～2009年鼠間及人間漢坦病毒的感染情況和基因特征,并與1986～1987年流行的HV相比較,從而闡明近年來HFRS流行改變的原因,尋找疾病演變的規(guī)律,為制定有效的預(yù)防和控制措施提供理論依據(jù)。 方法： 1、湖北地區(qū)鼠肺標本的收集：根據(jù)全國動物Ⅲ級地理劃分,獲取2000～2009年間江漢平原、鄂西南山地、鄂中丘陵、鄂東丘陵4個地區(qū)的5個采樣點的鼠肺標本；并收集各個地區(qū)嚙齒類動物分布特征、動物種類、構(gòu)成比和帶毒率等資料。 2、HV陽性鼠肺標本的篩選和總RNA的提�。翰杉院辈煌貐^(qū)的鼠肺標本,冰凍切片后使用間接免疫熒光法檢測HV抗原,提取抗原檢測陽性標本的總RNA和DNA。同時采集HV陰性標本鼠肺的DNA作為對照。 3、湖北地區(qū)HFRS患者血清的收集及篩選：收集1986～1987和2001～2009年間武漢大學(xué)(原湖北醫(yī)科大學(xué))附屬教學(xué)醫(yī)院收治住院的部分HFRS患者血清,經(jīng)臨床診斷和間接ELISA法檢測HV特異性IgM對標本進行篩選。 4、設(shè)計針對HV不同基因型的特異性引物,用RT-PCR法對病毒進行分型：根據(jù)GenBank中獲得的漢灘病毒(Hantaan virus, HTNV)和漢城病毒(Seoul virus SEOV)的S、M片段氨基酸序列和cDNA序列,用BioEdit 7.0和Clustal W程序排列,尋找cDNA序列及對應(yīng)氨基酸序列均保守的區(qū)域作為屬特異性引物設(shè)計區(qū)域,進而設(shè)計一對屬特異性的通用引物；隨后分別設(shè)計一組型特異性HTN/SEO引物。所有HV陽性標本均通過以上引物使用RT-PCR進行基因分型和擴增。 5、宿主動物線粒體DNA (Mitochondrial DNA. mtDNA)中D環(huán)區(qū)(D-loop)基因的特異性引物設(shè)計：根據(jù)GenBank中已有的褐家鼠、黑線姬鼠、黃胸鼠等鼠的D-loop基因序列,設(shè)計引物,用于擴增來源于湖北不同地區(qū)鼠肺標本中的宿主線粒體D-loop基因。 6、HV和宿主線粒體基因序列的獲得：將HTNV和SEOV的陽性PCR擴增產(chǎn)物以及D-loop擴增產(chǎn)物回收、純化后送上海In vitro gen公司測序。若有PCR產(chǎn)物直接測序效果不好的樣品,則采用克隆后測序。 7、HV與mtDNA D-loop序列的系統(tǒng)進化分析：使用生物學(xué)軟件BioEdit 7.0和ClustalX 2.0進行多重序列比對。使用RDP3 Beta 4.9軟件評估HTNV和SEOV核苷酸序列的基因重配情況。應(yīng)用Modeltest 3.7軟件中的赤池信息量準則,選擇系統(tǒng)分析中的最佳核酸替代模型。使用PAUP* 4b 10軟件和MrBayes 3.1軟件中的鄰接法(Neighbor-joining, NJ)和貝葉斯馬爾科夫鏈模特卡羅方法(Bayesian Markov chain Monte Carlo, BMCMC)構(gòu)建病毒與宿主系統(tǒng)發(fā)生樹。 8、HV序列同源性分析：應(yīng)用MEGA 4.1軟件分析來自湖北地區(qū)不同病毒株的S、M基因序列間的遺傳分歧。應(yīng)用Arlequin 3.11軟件和DnaSP 5.00軟件分析所有的序列的等位基因及等位基因的多態(tài)性與核酸的多態(tài)性。應(yīng)用Tajima's D test, Fu's Fs test and R2 test檢測持續(xù)性群體的大小和種群擴張情況。為了檢測分子進化選擇壓力,用DnaSP 5.00軟件檢測核酸序列無義突變(nonsynonymous, dN)和有意突變(synonymous, dS)的比值。 結(jié)果： 1、捕獲動物的構(gòu)成比和帶毒率：共捕獲687只動物,其中包括黑線姬鼠148只,褐家鼠507只,黃胸鼠32只,均為湖北地區(qū)較常見鼠類。其中褐家鼠為主要鼠種,所占比例高達73.80%。 2、鼠肺組織HV抗原的檢測：687份鼠肺標本中HV抗原總檢出率為6.70%,其中南漳最高為7.62%,江夏最低為6.08%。5個采樣地點的嚙齒動物的帶毒率無統(tǒng)計學(xué)差異,但每個地點不同鼠種HV的檢出率差別較大。南漳與蘄春地區(qū)只從褐家鼠中檢測出了病抗原。 3、鼠肺組織中HV RNA和其宿主DNA的測序結(jié)果：HV RNA的測序結(jié)果顯示：湖北地區(qū)鼠間流行的漢坦病毒主要為HTN型和SEO型。46份陽性鼠肺標本中,SEO型病毒有39份,HTN型漢坦病毒7份,SEOV為主要的漢坦病毒型別,占總陽性標本的84.78%。從湖北地區(qū)褐家鼠擴增出的病毒核苷酸序列均屬于SEO型病毒,從黑線姬鼠體內(nèi)同時檢測到4份SEOV與7份HTNV,提示該地區(qū)發(fā)生了SEO型漢坦病毒的宿主轉(zhuǎn)換現(xiàn)象,這也是首次發(fā)現(xiàn)在自然環(huán)境下,SEOV可以溢出感染黑線姬鼠。 4、鼠肺組織中漢坦病毒S片段序列分析：湖北地區(qū)鼠間SEOV的S片段可分為4個進化分枝。除了已知的SEO-S-#3外,還發(fā)現(xiàn)了3支新的進化分枝,分別命名為SEO-S-#7～SEO-S-#9。序列呈現(xiàn)一定的地區(qū)聚集性,來自同一采樣地點的的HV基本存在于同一進化分枝內(nèi)。大部分SEOV與Z37的同源性較高。湖北地區(qū)鼠間HTNV的S片段分為2個分枝,其中HTNV-S-#7為已知分枝,分枝內(nèi)病毒株與76-118同源性好。HTNV-S-#10為新發(fā)現(xiàn)的進化分枝,與Q32的同源性較高。 5、鼠肺組織中漢坦病毒M片段序列分析：SEOV的M片段可分為5個進化分枝。與SEOV的S片段的進化樹相比,SEO-M-#3和SEO-M-#8的組成分枝的成員與S片段一致；SEO-M-#7、SEO-M-#9和SEO-M-#10與S片段的進化樹組成有一定的差異,提示SEO型病毒發(fā)生了基因片段的重排。所有HTNV的M片段分為兩枝,HTNV-M-#-7和HTNV-M-#10,分枝組成與HTNV的S片段致。 6、宿主動物線粒體D-loop序列分析：構(gòu)建采集自不同地區(qū)陽性鼠肺標本以及部分HV檢測陰性標本的D-loop)序列系統(tǒng)進化樹,結(jié)果顯示HV抗原檢測陰性的鼠與HV檢出陽性鼠的遺傳距離很小,病毒感染與宿主線粒體基因沒有直接聯(lián)系；分析4個SEO型毒株來源的黑線姬鼠D-loop序列發(fā)現(xiàn),宿主轉(zhuǎn)換與宿主線粒體基因特征無關(guān)。 7、湖北地區(qū)人間流行的HV基因分析：湖北地區(qū)2000～2009人間流行的HV為SEOV和HTNV兩型,且與80年代HFRS流行高峰時期(1986～1987)的HV基因型類似。兩個時間段收集的SEO型病毒株均與Z37株同源性高,HTN型病毒株與76-118株同源性高。 結(jié)論： 1、證實目前湖北地區(qū)鼠間和人間流行的HV為SEOV和HTNV兩型。鼠間優(yōu)勢HV基因型為SEO型,HV的優(yōu)勢自然宿主為褐家鼠。2000～2009年間人間流行HV的基因型與1986～1987年間無較大差異,且與鼠間流行的已知SEO型病毒株Z37株和HTN型病毒株76-118株同源性高。推測鼠間病毒類型和自然宿主的變化可能是湖北地區(qū)HFRS流行趨勢改變的原因之一 2、首次發(fā)現(xiàn)SEOV溢出感染HTNV的自然宿主黑線姬鼠,以及SEOV不同進化分枝間基因片段的重排現(xiàn)象,說明SEOV進化活躍。 3、發(fā)現(xiàn)了3個新的SEOV進化分枝和1個新的HTNV進化分枝。多個SEOV進化分枝在湖北地區(qū)同時存在,表明該地區(qū)是SEOV的重要疫源地。結(jié)合生態(tài)學(xué)和古生物學(xué)的研究,我們推測長江中下游地區(qū)可能是SEOV古老的傳播中心。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R373

【參考文獻】

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本文編號：1772681