本文選題：斯氏貍殖吸蟲 + 線粒體基因　； 參考：《瀘州醫(yī)學(xué)院》2012年碩士論文

【摘要】：目的：擴增出斯氏貍殖吸蟲線粒體Cytb (cytochrome B)基因片段并測序,研究斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因在囊蚴期、30天幼蟲期、60天童蟲期、成蟲期和蟲卵期5個蟲期的表達情況,分析該基因?qū)ξx遺傳分類、蟲期物質(zhì)代謝及致病方面的意義。方法：(1)提取斯氏貍殖吸蟲成蟲基因組DNA,同時分別提取斯氏貍殖吸蟲5個蟲期的mRNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。基因組DNA和各蟲期cDNA保存于-20℃。(2)用日本血吸蟲線粒體cytb基因設(shè)計出斯氏貍殖吸蟲的線粒體cytb基因的兼并引物,擴增出蟲體囊蚴的總DNA,聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)法擴增出斯氏貍殖吸蟲cytb基因片段→電泳分離→提純→連接→轉(zhuǎn)化→挑菌→搖菌→送出測序。用所得的測序結(jié)果設(shè)計斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因片段的特異引物。(3) Blast與斯氏貍殖吸蟲cytb有親緣性的吸蟲,并用DNAsis等軟件分析這些吸蟲的線粒體cytb基因,然后用樹的方式表達它們的親緣關(guān)系。(4)以5個蟲期的cDNA為模板,特異引物為實驗組引物,衛(wèi)氏貍殖吸蟲的18SrDNA基因引物作為內(nèi)參引物做實時熒光定量PCR (realtime PCR)。根據(jù)所獲得的結(jié)果判斷斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因分別在5個蟲期的表達情況并分析其意義。結(jié)果：(1)獲得542bp的斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因片段,并將該基因片段納入NCBI基因庫中。根據(jù)該基因片段設(shè)計出一對斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因片段的特異引物CytbF:5'GGTTGCTTGATCATAACATTGG3'CytbR:5GACACTCTGGGTCGACCTTG5'(2)通過在Genebank數(shù)據(jù)庫中Blast發(fā)現(xiàn),斯氏貍殖吸蟲的此段cytb序列與日本血吸蟲(中國流行區(qū)蟲種)、異盤并殖吸蟲、哈氏并殖吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲以及斜睪吸蟲等有相似性,一共搜索到種7種具有同源性的蟲種,對這7種吸蟲線粒體cytb序列利用MEGA4計算遺傳距離,采用最大簡約法(MP)和鄰位相連法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,Bootstrap法檢驗,并用Clusterx軟件對7種吸蟲線粒體cytb序列進行多序列對比。結(jié)果顯示,用NJ和MP方法構(gòu)建的遺傳系統(tǒng)進化樹拓撲結(jié)構(gòu)相似,同時用MEGA4軟件對遺傳距離進行分析計算上,所得遺傳距離遠近分布與所得遺傳系統(tǒng)進化樹結(jié)果一致。(3) Realtime PCR結(jié)果顯示除了蟲卵期不見線粒體cytb基因的表達,其他蟲期均有表達。結(jié)論：1.線粒體cytb基因可作為吸蟲遺傳進化分類的依據(jù)。2.線粒體cytb基因在斯氏貍殖吸蟲不同蟲期的表達情況與不同時期該蟲對宿主的侵襲危害是成正相關(guān)的,也為以后的預(yù)防,診斷,治療提供理論依據(jù)。
[Abstract]:Objective: to amplify and sequence the mitochondrial Cytb gene of paragonimus skrjabini, and study the expression of mitochondrial cytb gene of P. skrjabini in 5 stages of larval stage, adult stage and egg stage of P. skrjabini in 30 days larval stage, 60 days larval stage, and 5 stages of egg stage.The significance of the gene in genetic classification, substance metabolism and pathogenicity of trematodes was analyzed.Methods Genomic DNA was extracted from adult P. skrjabini and mRNAs from 5 stages of paragonimus skrjabini were extracted and reversely transcribed as cDNA.Genomic DNA and cDNA were stored at -20 鈩，

本文編號：1771688