本文選題：骨髓間充質(zhì)干細胞 + 惡性轉(zhuǎn)化�。� 參考：《復旦大學》2011年博士論文

【摘要】：第一部分體外誘導人成體骨髓間充質(zhì)干細胞惡性轉(zhuǎn)化 目的：通過體外誘導的方法觀察人骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)體外惡性轉(zhuǎn)化的可能。 方法：培養(yǎng)成體MSCs,通過GM-CSF和IL-4誘導MSCs一個月以上,形成轉(zhuǎn)化后的骨髓間充質(zhì)干細胞(transformed mesenchymal cells, TMCs)。觀察TMCs的形態(tài),測定TMCs和MSCs的生長曲線、細胞周期。流式細胞儀檢測TMCs和MSCs的表面標志。并用western blot法檢測TMCs和MSCs端粒酶和c-myc的含量。 結(jié)果：用GM-CSF和IL-4誘導后6-8w, MSCs有部分細胞轉(zhuǎn)化成TMCs,其形態(tài)具備了惡性腫瘤細胞的特點。流式細胞技術(shù)檢測MSCs與TMCs表面標記物,發(fā)現(xiàn)TMCs CD13和CD105的陽性表達低于MSCs,而CD133和VEGFR2的陽性表達高于MSCs。TMCs生長速度比MSCs'快,其S期細胞含量為41.1%,較MSCs (9.67%)明顯增加,表明TMCs較MSCs有更強的增殖能力。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)TMCs中端粒酶的含量是MSCs的16.7倍(t=15.00,p=0.0001); TMCs c-myc的含量比MSCs增加了172.2%(t=10.58, P=0.0005)。 結(jié)論：MSCs體外培養(yǎng)時在GM-CSF和IL-4作用下可以發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 第二部分轉(zhuǎn)化后骨髓間充質(zhì)干細胞成瘤的體內(nèi)實驗 目的：通過動物實驗檢測轉(zhuǎn)化后的骨髓間充質(zhì)干細胞(TMCs)能否在動物體內(nèi)形成腫瘤,從而驗證MSCs發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化。 方法：經(jīng)尾靜脈注射實驗：45只NOD/SCID小鼠分3組,每組15只,分別為TMCs組,MSCs對照組和空白對照組。實驗組和MSCs對照組分別將2.5×105 cells/ml的細胞懸液200μ1經(jīng)尾靜脈注射至NOD/SCID小鼠體內(nèi),空白組注射200μl PBS。在第3、7、14、21和25d每組分別處死裸小鼠各3只。取出肺臟,稱重,并計數(shù)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。將肺臟標本切片行HE染色和免疫組化檢查。 經(jīng)皮下注射實驗：將18只6周齡雄性BALB/C-nu裸小鼠分為TMCs組、MSCs對照組和空白對照組,每組6只。實驗組和MSCs對照組分別將2.5×105 cells/ml的細胞懸液200μ1注射至6周齡BALB/C裸小鼠前臂內(nèi)側(cè)皮下,空白對照組注射200μl PBS。第25d處死小鼠,取出皮下腫瘤病灶測量大小并稱重。腫瘤標本切片行HE染色和免疫組化檢查。 結(jié)果：尾靜脈注射時發(fā)現(xiàn)第7d TMCs組開始出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),第14d開始所有裸鼠均發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移。MSCs對照組和空白對照組均沒有轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成。TMCs和MSCs兩組裸鼠在3、7、14d時鼠肺濕重差別沒有統(tǒng)計學意義。而21d、25d時TMCs組鼠肺濕重明顯增加。HE染色腫瘤細胞排列紊亂,核大小、形狀和染色不一,并可見多核、異型核等,具備了惡性腫瘤細胞的特點。免疫組化結(jié)果肺部轉(zhuǎn)移灶中鼠肺細胞的CD133陽性率明顯增加。皮下注射組所有TMCs組12～16d均在裸鼠皮下形成腫瘤,體積為3.02±0.83cm3,重量1.37±0.16g；而對照組均未形成腫瘤結(jié)節(jié)。皮下腫瘤組織免疫組化結(jié)果顯示VIM(+),DES(+),SMA(+),CD133(+), CD34(+),S100(+), NSE(-),PA-CK(-),EMA(-),DFAP(-),提示腫瘤可能為橫紋肌來源惡性腫瘤,同時顯示TMCs具有干細胞特性,能向不同種類細胞分化。 結(jié)論：TMCs為惡性腫瘤細胞,無論通過尾靜脈注射或皮下種植均能在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。MSCs不能在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。 第三部分siRNA抑制hTERT基因表達對轉(zhuǎn)化后骨髓間充質(zhì)干細胞的影響 目的：探討小干擾RNA (siRNA)抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)表達對轉(zhuǎn)化后骨髓間充質(zhì)干細胞(TMCs)增殖和在動物體內(nèi)成瘤能力的影響。 方法：構(gòu)建針對人hTERT的siRNA,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將hTERT-siRNA轉(zhuǎn)染TMCs。實驗分為3個濃度組,分別為50nmol/L, 100nmol/L和200nmol/L,設(shè)陰性對照組和空白對照組。用MTT法和流式細胞儀檢測siRNA對TMCs生長增殖和凋亡的影響。用western blot檢測各濃度組TMCs的端粒酶蛋白的含量。RT-PCR各濃度組hTERT mRNA的含量,并用TRAP-ELISA法檢測各濃度組TMCs端粒酶的活性。通過BALA/C裸鼠檢測siRNA轉(zhuǎn)染后各組TMCs在動物體內(nèi)成瘤能力的變化。 結(jié)果：通過western blot,我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的hTERT-siRNA組TMCs的端粒酶蛋白含量逐漸減少,與siRNA的濃度呈負相關(guān),50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L組分別下降了46.2%,69.5%和91.5%; MTT法檢測3個濃度組hTERT-siRNA對細胞的生長抑制率分別為2.74%、7.26%和10.23%。其中50nmol/L組和對照組之間差別沒有統(tǒng)計學意義,而100nmol/L組和200nmol/L組與陰性對照組之間差別有統(tǒng)計學意義。流式細胞儀檢測50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L hTERT-siRNA轉(zhuǎn)染組的TMCs凋亡率分別為：5.12%,6.67%和8.04%,各組和對照組相比差別均有統(tǒng)計學意義。RT-PCR檢測結(jié)果顯示50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L hTERT-siRNA轉(zhuǎn)染組hTERT基因分別下降了19.2%,47.2%,86.4%。TRAP-ELISA法檢查發(fā)現(xiàn),不同濃度的hTERT-siRNA對TMCs的端粒酶活性都產(chǎn)生抑制作用,3組分別下降了11.0%,42.9%,86.2%。100nmol/L組和對照組TMCs在裸鼠皮下形成腫瘤的時間相似,分別為14.8d和14.2d; 200nmol/L組成瘤時間較晚,為17.3d。對照組形成的皮下腫瘤體積和重量分別為2.56cm3和1.30g,而100nmol/L和200nmol/L組腫瘤體積分別為0.64cm3和0.31cm3；重量分別為0.78g和0.58g,與對照組間差別均有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論：siRNA可以下調(diào)hTERT基因的表達,減少TMCs細胞內(nèi)端粒酶的含量,也降低了端粒酶的活性,從而增加了TMCs的凋亡、抑制了TMCs的生長,并降低了TMCs在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。端粒酶在MSCs惡性轉(zhuǎn)化的過程中可能起了重要的作用。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【引證文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 劉建平;體外模擬腫瘤微環(huán)境中致大鼠MSCs瘤化相關(guān)因子分析[D];重慶醫(yī)科大學;2012年

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本文編號：1768148