本文選題：丁苯酞 + 肌萎縮側(cè)索硬化�。� 參考：《河北醫(yī)科大學》2012年碩士論文

【摘要】：肌萎縮側(cè)索硬化（Amyotrophic lateral sclerosisALS）又名運動神經(jīng)元病(motor neuron disease MND)或盧·格里格(Lou Gehrig)病，是一種致命性神經(jīng)退行性疾病，選擇性累及皮層、腦干和脊髓的運動神經(jīng)元，臨床表現(xiàn)為進行性加重的肌萎縮、無力和吞咽困難、飲食水發(fā)嗆,最終因呼吸肌麻痹死亡。90%的ALS為散發(fā)性(SALS)，10%的ALS為家族性(FALS)，其中約20%的FALS與Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD1）基因突變有關(guān)。該病目前缺乏有效的治療方法，病人的存活期一般為3-5年。盡管多年來有許多藥物治療研究，利魯唑仍是惟一被FDA批準應(yīng)用于治療ALS的藥物，但也只能有限的延長病人的生存期，因此尋找有效的治療藥物是非常必要的。 盡管ALS發(fā)病機制不清，異常磷酸化的神經(jīng)絲在脊髓前角運動神經(jīng)元聚集被認為是ALS的重要病理特征之一。神經(jīng)絲（Neurofilaments NF）屬于細胞骨架蛋白中的一種，根據(jù)其分子量的不同分為三個不同的亞基蛋白，分別為神經(jīng)絲重鏈（NF-H，200-kDa）、神經(jīng)絲中鏈（NF-M，160-kDa）和神經(jīng)絲輕鏈（NF-L，68-kDa）。其中NF-L在神經(jīng)絲的組裝方面起重要作用, NF-M和NF-H在維持神經(jīng)絲的交聯(lián)作用、軸突細胞骨架蛋白的穩(wěn)定性、軸突直徑大小和軸漿轉(zhuǎn)運方面起重要作用。一般情況下，神經(jīng)絲在神經(jīng)元胞漿內(nèi)以非磷酸化形式存在，而軸索內(nèi)的神經(jīng)絲以磷酸化形式存在，對維持軸索的直徑等有重要作用。但是，異常磷酸化的神經(jīng)絲的可以抑制神經(jīng)絲蛋白的降解，導(dǎo)致其在核周異常聚集，最終引起神經(jīng)元變性、死亡。 丁苯酞（dl-3-n-Butylphthalide）是芹菜（中國芹菜）種子的提取物。在2002年，首次被中國國家食品藥品監(jiān)督管理局批準應(yīng)用于中風患者。實驗證明丁苯酞具有減少氧化應(yīng)激損傷和改善線粒體功能、抑制炎癥反應(yīng)和抗細胞凋亡的作用。最近，在阿爾茨海默病鼠模型中研究顯示，丁苯酞能明顯改善轉(zhuǎn)基因鼠的認知功能。然而，目前關(guān)于丁苯酞在ALS治療作用的相關(guān)研究報道很少。 基于此，本實驗觀察丁苯酞對SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠的行為學影響，并進一步探討可能的神經(jīng)保護作用機制。本研究分為兩部分： 第一部分預(yù)防應(yīng)用不同劑量的丁苯酞對家族性肌萎縮側(cè)索硬化鼠模型的神經(jīng)保護作用 目的：觀察不同劑量的丁苯酞在發(fā)病前給藥對SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠的行為學影響，并觀察180mg/kg丁苯酞治療組對SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠脊髓前角運動神經(jīng)元神經(jīng)絲重鏈的分布和表達水平的影響。 方法： 1動物分組及給藥方法 隨機將48只攜帶SOD1-G93A基因的小鼠分為四個實驗組（n=12，雌性6只，雄性6只）：分別為低劑量治療組（60mg/kg）、中劑量治療組（120mg/kg）、高劑量治療組（180mg/kg）和安慰劑組。 丁苯酞（純度98%）由石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司提供，三個治療組分別以6mg/ml,12mg/ml和18mg/ml的濃度將丁苯酞溶于玉米油中，安慰劑組給玉米油。丁苯酞和玉米油按10ml/kg/d的劑量給藥。有12只（6只雌性和6只雄性）同窩陰性對照不接受任何治療。SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠的給藥時間為第42天。 2行為學觀察 2.1發(fā)病時間和死亡時間的判定 在83天進行一般狀況評分，評分標準參考Vercelli等人研究的1-5分評分法：4分為發(fā)病時間，1分為死亡時間。 5分：無運動功能障礙 4分：將小鼠懸吊時出現(xiàn)后肢伸展異�；蛘痤� 3分：明顯的后肢無力、步態(tài)異常 2分：雙后肢完全癱瘓，爬行僅靠前肢。 1分：雙后肢完全癱瘓，并且將小鼠仰臥后20s內(nèi)不能翻轉(zhuǎn)。 2.2旋轉(zhuǎn)實驗 第10周開始轉(zhuǎn)棒實驗，實驗前5天為轉(zhuǎn)基因鼠的適應(yīng)和學習階段，以后每周測一次。轉(zhuǎn)棒儀從1轉(zhuǎn)/分開始，3分鐘內(nèi)達到30轉(zhuǎn)，每只小鼠測三次，記錄轉(zhuǎn)棒時間最長的一次。 3免疫組化 10%水合氯醛將小鼠麻醉后，心臟灌注4%多聚甲醛固定20min，取小鼠脊髓腰段以4%多聚甲醛固定48h，振動切片30μm厚，免疫組織化學法觀察髓前角神經(jīng)元SMI-31和SMI-32的表達分布。 4免疫印跡 10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射將小鼠麻醉后，新鮮取小鼠脊髓腰段，液氮速凍，-80℃儲藏，提取總蛋白并用蛋白免疫印跡的方法檢測SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠腰髓SMI-31蛋白表達。 5統(tǒng)計學方法 我們采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤（x±SEM）表示。Kaplane-Meier（K-M）生存分析用于發(fā)病時間和生存時間的統(tǒng)計分析，轉(zhuǎn)棒實驗使用重復(fù)測量設(shè)計多因素方差分析進行統(tǒng)計。其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析或秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1發(fā)病時間和生存時間 1.1發(fā)病時間 與安慰劑組相比，60mg/kg、120mg/kg和180mg/kg丁苯酞治療組分別使SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠的發(fā)病時間推遲了11、6、和13天，三組均有統(tǒng)計學意義。 1.2生存時間 與安慰劑組相比，60mg/kg、120mg/kg和180mg/kg丁苯酞治療組分別使SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠的生存期延長了6、2、和12天，僅180mg/kg治療組有顯著統(tǒng)計學差異（P=0.08）。 2運動功能的評價 與安慰劑組相比，從13周到16周，180mg/kg治療組明顯延長了SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠的轉(zhuǎn)棒時間，有統(tǒng)計學意義。60mg/kg和120mg/kg治療組可輕微延長轉(zhuǎn)棒時間，但與安慰劑組相比無統(tǒng)計學意義。 3免疫組化 SMI-32免疫組化結(jié)果顯示，與安慰劑組相比，180mg/kg治療組脊髓前角SMI-32陽性運動神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，P=0.000，有顯著的統(tǒng)計學差異，且胞漿染色深，突起相對多。 SMI-31免疫組化的結(jié)果顯示，與安慰劑組相比，180mg/kg治療組脊髓前角SMI-31陽性運動神經(jīng)元數(shù)量明顯少，P=0.000，有顯著統(tǒng)計學差異，且核周著色相對較淺，未見明顯的包涵體形成。 4免疫印跡 與安慰劑組相比，丁苯酞治療組SMI-31的表達水平是降低的，P=0.006，有統(tǒng)計學差異。 結(jié)論：丁苯酞具有推遲SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠發(fā)病時間、延長生存期和改善其運動功能的作用，部分抑制神經(jīng)絲異常磷酸化。第二部分丁苯酞對發(fā)病后雄性家族性肌萎縮側(cè)索硬化鼠模型行為學的影響 目的：觀察丁苯酞對發(fā)病后雄性SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠生存期和運動功能的影響。 方法： 1分組和給藥方法 將20只雄性SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠隨機分為2組（N=10，雄性）：（1）丁苯酞（180mg/kg）治療組，第90天給藥;(2)安慰劑組，第90天給玉米油。 丁苯酞（純度98%）由石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司提供，將丁苯酞以18mg/ml的濃度溶于玉米油中，安慰劑組給玉米油。丁苯酞和玉米油按10ml/kg/d的劑量給藥。給藥方式為灌胃法。 2行為學測定 第13周開始轉(zhuǎn)棒實驗，每周測一次，實驗前5天為轉(zhuǎn)基因鼠的適應(yīng)和學習階段，以后每周測一次。轉(zhuǎn)棒儀從1轉(zhuǎn)/分開始，3分鐘內(nèi)達到30轉(zhuǎn)，每只小鼠測三次，記錄轉(zhuǎn)棒時間最長的一次。 3死亡時間的判定 參考Vercelli等人研究的1-5分評分法，4分為發(fā)病時間，1分為死亡時間。 4統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。各組數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準誤（x±SEM）表示。Kaplane-Meier（K-M）生存分析用于發(fā)病時間的統(tǒng)計分析，轉(zhuǎn)棒實驗采用重復(fù)測量設(shè)計多因素方差分析進行統(tǒng)計。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1生存時間 與安慰劑組相比，丁苯酞治療組轉(zhuǎn)基因鼠的生存時間被延長了約8天，P=0.046，有統(tǒng)計學意義。 2運動功能評價（轉(zhuǎn)棒法） 從第13周到第18周，，丁苯酞治療組能輕微延長轉(zhuǎn)基因鼠的轉(zhuǎn)棒時間，但與安慰劑相比，P0.05，無統(tǒng)計學差異。 結(jié)論：丁苯酞能延長發(fā)病后雄性SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠生存時間作用。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R744;R-332

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 常青,王曉良;手性3-n丁基苯酞對大鼠局灶性腦缺血誘導(dǎo)的凋亡的影響(英文)[J];Acta Pharmacologica Sinica;2003年08期

2 董高翔,馮亦璞;丁基苯酞對局部腦缺血再灌注大鼠腦線粒體ATPase,抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化的影響[J];中國醫(yī)學科學院學報;2002年01期

本文編號：1764011