發(fā)布時間：2018-04-16 11:35

  本文選題：低壓缺氧 + 大鼠��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的:通過建立低壓缺氧模型,模擬急性高原缺氧損傷,觀察不同缺氧時間點腦、肺組織損傷情況,并采用2-DE和MALDI-TOF-MS技術(shù)研究急性高原缺氧損傷腦線粒體蛋白的差異表達(dá),以尋找其可能的分子標(biāo)志物及藥物治療靶點。 方法:選清潔級雌性SD大鼠60只,體重230±20g,以完全隨機分組方法分為正常對照組(Control)、低壓缺氧6h組、12h組、24h組。建立大鼠急性低壓缺氧損傷模型,控制艙內(nèi)溫度、濕度、氣流量及氧含量,模擬海拔7000m高度(艙內(nèi)壓力降至真空度0.06MPa)。急性高原缺氧損傷模型的建立:通過H.E染色和甲苯胺蘭染色觀察腦、肺組織形態(tài)學(xué)改變;干濕比重法檢測腦、肺含水量,應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測腦、肺組織水通道蛋白(AQP)1、水通道蛋白4表達(dá)情況;生化手段檢測血清乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量。 急性高原缺氧損傷后腦線粒體差異蛋白的表達(dá)研究:分離純化大腦皮質(zhì)線粒體,提取各組線粒體蛋白,經(jīng)雙向電泳和銀染得到雙向電泳圖譜,用PDQuest 7.0軟件進行圖像分析尋找差異蛋白點;進行考染,取蛋白點進行酶解,再用MALDL-TOF質(zhì)譜進行分析,使用Mascot軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫中進行搜索,初步確定差異蛋白質(zhì)的種類及其在損傷過程中的作用;通過Western blot進一步驗證檢測的蛋白。 結(jié)果:1低壓缺氧損傷后腦組織形態(tài)學(xué)改變:腦冠狀切片H.E染色可見各低壓缺氧組出現(xiàn)不同程度細(xì)胞損傷,神經(jīng)細(xì)胞胞體縮小,核固縮、溶解,胞漿深染;隨低壓缺氧時間的延長,損傷逐漸加重。 2腦、肺含水量檢測結(jié)果:與對照組相比,各低壓缺氧組腦、肺含水量顯著升高(P0.01),且隨低壓缺氧時間的延長而逐漸增加。 3腦、肺組織AQP1、AQP4檢測結(jié)果:各低壓缺氧組腦組織AQP1、AQP4表達(dá)量較對照組相比明顯增高,且隨低壓缺氧時間的延長而逐漸增高。肺組織AQP1、AQP4表達(dá)量在低壓缺氧組較對照組增高,其中AQP4的表達(dá)量隨低壓缺氧時間的延長而逐漸增高,而AQP1隨低壓缺氧時間的延長變化不明顯。 4生化指標(biāo)檢測結(jié)果:各低壓缺氧組血清LDH活性與對照組相比顯著增高(P0.01),且隨低壓缺氧時間的延長而逐漸增高;各低壓缺氧組血清SOD活性與對照組相比顯著降低(P0.01),且隨低壓缺氧時間的延長而逐漸降低;血清CAT活性在低壓缺氧6h、12h組較對照組明顯降低(P0.01),低壓缺氧24h組有所升高,但仍低于對照組;各低壓缺氧組MDA含量較對照組明顯增加。 5線粒體分離純化結(jié)果檢驗透射電鏡觀察顯示:提取的沉淀中主要成分是線粒體。純化的線粒體為圓形或橢圓形,絕大多數(shù)線粒體有完整的膜性結(jié)構(gòu)。線粒體純度超過95%。 6大鼠低壓缺氧損傷前后腦皮質(zhì)線粒體蛋白雙向電泳圖譜分析本實驗選用17cm、pH3-10范圍的線性IPG膠條,對各組蛋白進行分離、分析。在2-DE膠圖上可以看到蛋白點多分布于PI 4.5-10、MW 15kDa-105kDa的范圍。 經(jīng)PDquest軟件分析檢測發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比(P0.05),低壓缺氧6h組表達(dá)升高的有12個點,降低的有4個點;低壓缺氧12h組表達(dá)升高的有16個點,降低的有5個點;低壓缺氧24h組表達(dá)升高的有30個點,降低的有6個點。其中有25個點在低壓缺氧各時間點表達(dá)變化相一致;有1個點在低壓缺氧24h組新表達(dá)。選取在兩個及兩個以上低壓缺氧時間點具有共同表達(dá)變化趨勢或是變化趨勢具有時間依賴性的點作為差異蛋白點進行后續(xù)分析。 7差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定 對所取得的差異蛋白點進行了MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定,得分大于61(p0.05 )可確認(rèn)蛋白質(zhì)種類。分別是二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2(dihydropyrimidinase-related protein 2)、肌酸激酶(creatine kinase)、異戊酰-CoA脫氫酶(isovaleryl-CoA dehydrogenase)、翻譯延長因子Ts(Ts translation elongation factor )、F1-ATPaseβ亞單位( F1-ATPase beta subunit)、3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase)、電子傳遞黃素蛋白α(Electron transfer flavoprotein alpha subunit)、烯酰CoA水解酶A鏈(Chain A, 2-Enoyl-Coa Hydratase)、NADH脫氫酶(泛醌)鐵硫蛋白8(NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 8)、原肌球蛋白β鏈(tropomyosin beta chain)。 8蛋白免疫印跡驗證Western-blot結(jié)果顯示:ATPaseβ亞單位(ATP5B)和電子傳遞黃素蛋白α(ETFA)在大鼠腦皮質(zhì)線粒體中存在表達(dá),而且兩種蛋白在低壓缺氧損傷后的變化趨勢與雙向電泳圖像經(jīng)PDQuest軟件分析后得到的蛋白質(zhì)變化趨勢相一致。 結(jié)論:1形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),低壓缺氧可造成大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷,包括細(xì)胞水腫、胞核固縮,壞死、凋亡和Nissl體減少或消失;其損傷程度隨低壓缺氧時間的延長而加重。2低壓缺氧造成大鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷。SOD和CAT活性降低而MDA蓄積增加;LDH活性升高。3低壓缺氧可引起腦、肺組織水通道蛋白表達(dá)改變,可能致使低壓缺氧后大鼠腦、肺含水量增加,出現(xiàn)腦水腫、肺水腫,且水腫的嚴(yán)重程度隨低壓缺氧時間的延長而加劇。4低壓缺氧可引起腦皮質(zhì)線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)變化。各組腦皮質(zhì)線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)存在差異,提示低壓缺氧可引起眾多線粒體蛋白因子表達(dá)發(fā)生變化,他們可能參與低壓缺氧性腦損傷。低壓缺氧可能引起脂肪酸β-氧化和氧化磷酸化相關(guān)蛋白的改變,從而影響細(xì)胞能量代謝水平。低壓缺氧可誘導(dǎo)線粒體的蛋白質(zhì)分解及合成功能增強,以翻新因自由基等造成的線粒體結(jié)構(gòu)蛋白的氧化性損傷。低壓缺氧造成腦損傷的同時,腦組織也可能通過一系列代償機制來應(yīng)對損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1758746