發(fā)布時(shí)間：2018-04-15 17:06

  本文選題：CD80 + 單鏈抗體　； 參考：《蘇州大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：CD80(也稱B7-1)是B7家族重要的共刺激分子。人CD80分子編碼基因定位于人類染色體3q13.3-q21區(qū)內(nèi),含有1491bp。CD80是分子量約為44-54kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要表達(dá)在專職性抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell,APC)樹突狀細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞。CD80分子的配體為表達(dá)在T淋巴細(xì)胞表面的CD28和CTLA-4。CD80與CD28結(jié)合為T細(xì)胞的活化提供第二信號(hào),促進(jìn)T細(xì)胞的增殖與分化;而與CTLA-4結(jié)合介導(dǎo)抑制信號(hào),從而下調(diào)或終止T細(xì)胞效應(yīng)。若缺乏此共刺激信號(hào),抗原特異性的第一信號(hào)非但不能有效激活特異性T細(xì)胞,反而導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)能,或者耐受。研究表明,CD80介導(dǎo)的信號(hào)通路不僅能調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化過(guò)程,而且還參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后狀況。單鏈抗體(single-chain variable fragment,ScFv)是一種小分子的抗體,含有完整的抗原結(jié)合位點(diǎn),由重鏈可變區(qū)(the variable heavy chain,VH)和輕鏈可變區(qū)(the variable light chain,VL)通過(guò)一段連接肽連接而成,大小為26-28kDa。VH和VL之間的連接肽長(zhǎng)度為10-25個(gè)氨基酸,最為普遍的為(Gly4Ser)3十五肽。Diabody是單鏈抗體的二聚體形式,是通過(guò)將單鏈抗體VH和VL之間的連接肽縮短至3-10個(gè)氨基酸時(shí),可促進(jìn)分子間VH和VL的配對(duì)而形成。 第一部分抗人CD80單鏈抗體(ScFv)的研制及生物學(xué)功能初步研究 1.目的:構(gòu)建及表達(dá)抗人CD80單鏈抗體(ScFv),鑒定其抗原抗體結(jié)合活性,并初步研究其生物學(xué)功能。 2.方法:采用RT-PCR法從分泌鼠抗人CD80 McAb的雜交瘤細(xì)胞株(4E5)中克隆VH和VL基因。用重疊延伸拼接PCR方法構(gòu)建具有前導(dǎo)肽的L-VH-Linker-VL單鏈抗體基因,并克隆至pIRES2-EGFP表達(dá)載體,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO),G418加壓篩選。純化抗人CD80-ScFv,分析其效價(jià),并鑒定其對(duì)膜型CD80的識(shí)別。競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)分析抗人CD80-ScFv與相應(yīng)抗原的結(jié)合能力。MTT法體外分析抗人CD80-ScFv對(duì)Raji細(xì)胞體外增殖的抑制作用和對(duì)CD80介導(dǎo)的共刺激信號(hào)的阻斷作用。 3.結(jié)果:構(gòu)建的抗人CD80-ScFv基因全長(zhǎng)為828bp,經(jīng)測(cè)序含有信號(hào)肽和連接肽編碼基因。實(shí)驗(yàn)獲得穩(wěn)定分泌細(xì)胞株(命名為SA-Ⅱ)。上清中抗體得率為15.12mg/L,相對(duì)效價(jià)為2.0μg/5×105個(gè)細(xì)胞。該抗體與天然表達(dá)CD80分子的Raji和Daudi細(xì)胞陽(yáng)性結(jié)合率分別為96.6%和95.0%�？谷薈D80-ScFv對(duì)鼠源親本抗體4E5與抗原結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)抑制率達(dá)98.67%,并能抑制Raji細(xì)胞的體外增殖,而且能阻斷CD80介導(dǎo)的共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制PBMC的增殖,增殖率下降43.48%。 4.結(jié)論:成功構(gòu)建的表達(dá)抗人CD80-ScFv的細(xì)胞株,其分泌的抗體具有良好的生物學(xué)活性。該抗體的研制在CD80及相關(guān)分子的基礎(chǔ)或/及臨床研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 第二部分抗人CD80雙價(jià)抗體(diabody)的研制及生物學(xué)功能初步研究 1.目的:構(gòu)建及表達(dá)抗人CD80雙價(jià)抗體(diabody),并初步研究其生物學(xué)功能。 2.方法:PCR法獲得輕重鏈可變區(qū)基因,構(gòu)建表達(dá)載體pIRES2- EGFP/diabody。將pIRES2-EGFP/diabody轉(zhuǎn)染中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO),G418加壓,篩選穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株,擴(kuò)大培養(yǎng)并收集上清,經(jīng)鎳柱純化,并經(jīng)變性及非變性SDS-PAGE電泳對(duì)抗體分子的雙體性進(jìn)行鑒定。以鼠源性親本抗體4E5為對(duì)照,測(cè)定抗人CD80-diabody的效價(jià)。采用免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析抗體與細(xì)胞膜型CD80分子的結(jié)合活性及與鼠源性親本抗體4E5的競(jìng)爭(zhēng)抑制效應(yīng);MTT法分析該抗體對(duì)天然高表達(dá)CD80的Raji細(xì)胞體外增殖的影響,同時(shí)分析其對(duì)CD80介導(dǎo)的共刺激信號(hào)阻斷作用的影響。 3.結(jié)果:成功構(gòu)建抗人CD80-diabody表達(dá)載體,基因全長(zhǎng)為798bp,含有信號(hào)肽和Gly4Ser連接肽編碼基因。獲得了穩(wěn)定分泌雙價(jià)抗體的細(xì)胞株(命名為SA-Ⅲ),培養(yǎng)上清中純化抗體的得率為15mg/L,PAGE結(jié)果顯示其為一個(gè)二聚體,Mr約為53kD(a抗人CD80-ScFv Mr約為27kDa)�？谷薈D80-diabody的效價(jià)為1.5μg/5×105個(gè)細(xì)胞,與L929-CD80、Raji及Daudi的陽(yáng)性結(jié)合率分別為96.5%、98.1%及93.0%;該抗體對(duì)鼠源親本抗體4E5與抗原結(jié)合的抑制率為97.11%,對(duì)Raji細(xì)胞體外增殖的抑制率達(dá)31.27%。同時(shí)也能阻斷CD80介導(dǎo)的共刺激信號(hào)。與單鏈抗體相比,親和活性明顯提高。 4.結(jié)論:成功獲得了分泌抗人CD80-diabody的CHO細(xì)胞株,該抗體具有良好的生物學(xué)活性,親和活性較單鏈抗體也明顯提高,為進(jìn)一步對(duì)CD80分子的研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 朱艷;鄭峰豐;陳永井;邱玉華;朱江;;抗人CD28單鏈抗體基因的構(gòu)建及在BmN細(xì)胞和家蠶中的表達(dá)[J];生物工程學(xué)報(bào);2007年04期

2 高增燕;孫杰;王艷茹;劉玉華;邱玉華;施勤;;降植烷誘導(dǎo)C57BL/J6狼瘡性腎病鼠模型的建立和生物學(xué)鑒定[J];蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年03期

3 彭國(guó)平;周承;吳煒;孫雯;田鋒;賀紀(jì)凱;陳智;;抗鼠CTLA-4單鏈抗體的構(gòu)建與表達(dá)及其免疫學(xué)活性的鑒定[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年03期

4 沈_";張愛(ài)華;閉蘭;史良如;;抗人CD25分子單鏈抗體基因的構(gòu)建、表達(dá)及初步鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2007年03期

5 王艷茹;馬泓冰;陳永井;朱華亭;劉玉華;杜陽(yáng)陽(yáng);孫杰;陳明心;邱玉華;;CD80人-鼠嵌合抗體對(duì)B淋巴瘤細(xì)胞株Raji與Daudi的生長(zhǎng)抑制及殺傷作用[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2009年07期

6 邱玉華,季玉紅,郭玲,周照華,王月丹,傅晉翔,張學(xué)光;鼠抗人B7-1分子功能性單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2000年11期

7 徐耀瑜;胡玲玲;陳永井;程鋼;羅先富;孫杰;劉玉華;王艷茹;陳明心;邱玉華;;CD80鼠-人嵌合抗體的CHO細(xì)胞表達(dá)及體外生物學(xué)功能的初步研究[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2009年02期

8 高增燕;邱玉華;謝芳;顧永平;楊天杰;黃莉;楊曉惠;施勤;;B7-1抗體阻斷B7/CD28信號(hào)通路對(duì)Pristane腎病的治療作用[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2010年10期

9 丁世華;楊冬華;盧筱華;湯紹輝;葉剛;;特異性抗肝癌單鏈抗體的表達(dá)及意義[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2008年11期

，

本文編號(hào)：1755013