本文選題：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 + 胰腺損傷��； 參考：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：研究目的 1.探討B(tài)MSCs在胰腺損傷修復(fù)中的作用 2.探討B(tài)MSCs在慢性胰腺炎纖維化中的作用 3.探討MicroRNA是否可以作為CP-PDAC過程中標(biāo)志物 研究方法 1.建立C57/BL6小鼠胰腺損傷模型(65%～70%胰腺部分切除),通過尾靜脈注射表達(dá)綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)的小鼠BMSCs (GFP+ BMSCs的表面標(biāo)志用流式細(xì)胞術(shù)檢測,成脂和成骨分化能力用相應(yīng)的成脂和成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)檢測),應(yīng)用GFP免疫組織化學(xué)技術(shù)分析BMSCs在損傷胰腺中的遷移與分布；運(yùn)用胰腺導(dǎo)管上皮標(biāo)志CK-19,胰島p細(xì)胞標(biāo)志Insulin,胰腺星狀細(xì)胞標(biāo)志Desmin和α-SMA,血管內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志CD31和神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志Nestin與GFP免疫熒光雙染激光共聚焦成像技術(shù)分析胰腺組織中BMSCs的表型,并統(tǒng)計(jì)GFP+/CK19+, GFP+/Insulin+, GFP+/Desmin+, GFP+/α-SMA+, GFP+/CD31+, GFP+/Nestin+亞群所占比例；用電子秤稱量手術(shù)四周后的小鼠體重和胰腺重量,計(jì)算胰腺／體重比；將四周后的小鼠胰腺消化為單細(xì)胞懸液,用流式細(xì)胞術(shù)分選出GFP+的細(xì)胞。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測分選出的GFP+的細(xì)胞,野生型(Wild type) BMSCs和GFP+ BMSCs中4種MicroRNA (miR-9, miR-204, miR-375和miR-34a)的表達(dá)。接受GFP+ BMSCs注射的正常小鼠和不接受GFP+ BMSCs注射的胰腺損傷小鼠作為對照。 2.建立C57/BL6小鼠慢性胰腺炎模型(蛙皮素誘導(dǎo)8周),通過尾靜脈注射GFP+小鼠BMSCs(表面標(biāo)志和成脂成骨能力檢測同前),應(yīng)用GFP免疫組織化學(xué)技術(shù)分析BMSCs在纖維化胰腺中的遷移與分布；運(yùn)用胰腺星狀細(xì)胞標(biāo)志Desmin和α-SMA, MMP-2和MMP-9與GFP免疫熒光雙染激光共聚焦成像技術(shù)分析胰腺組織中BMSCs的表型,并統(tǒng)計(jì)GFP+/CK19+, GFP+/Insulin+, GFP+/Desmin+, GFP+/α-SMA+, GFP+/CD31+亞群所占比例；用天狼星紅(Sirius red)染色和Image Pro Plus軟件檢測胰腺組織的纖維化程度；用Western blotting技術(shù)檢測胰腺組織中MMP-9和MMP-2的表達(dá)水平。不接受GFP+ BMSCs注射的慢性胰腺炎胰腺小鼠作為對照。 3.建立大鼠慢性胰腺炎-胰腺癌(CP-PDAC)模型：將大鼠胰膽管部分結(jié)扎(75%),8周內(nèi)形成慢性胰腺炎,然后在大鼠胰腺內(nèi)包埋二甲基苯并葸(7,12-dimethylbenzanthracene, DMBA)粉末,三個(gè)月內(nèi)形成胰腺癌。只包埋DMBA的大鼠作為對照組。在不同時(shí)間點(diǎn)取大鼠模型的胰腺標(biāo)本,用qRT-PCR檢測不同病變程度胰腺中相關(guān)MicroRNA (miR-34a,miR-204, miR-107和miR-21)的表達(dá),比較MicroRNA在正常胰腺,不同程度纖維化胰腺,PanINs病變和PDAC中的表達(dá)差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.免疫組化的結(jié)果顯示GFP廣泛表達(dá)于損傷胰腺的實(shí)質(zhì)和間質(zhì)中,其中導(dǎo)管結(jié)構(gòu)中有18.5±3.3%,血管結(jié)構(gòu)中有23.4±5.6%,腺泡結(jié)構(gòu)中有3.4±1.5%,胰島結(jié)構(gòu)中沒有,其它間質(zhì)中有54.7±8.9%。免疫熒光雙染共聚焦技術(shù)顯示GFP+BMSCs分化為胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞(占1.7±0.3%),胰腺星狀細(xì)胞(占5.2±1.6%),血管內(nèi)皮細(xì)胞(占3.2±0.6%),沒有發(fā)現(xiàn)其分化為胰島細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。損傷胰腺中的GFP+ BMSCs和其分化的細(xì)胞遠(yuǎn)多于正常胰腺。對于部分切除胰腺的小鼠,接受GFP+ BMSCs注射的小鼠的胰腺重量／體重比((0.225±0.042)%)高于未接受GFP+ BMSCs注射的小鼠((0.183±0.021)%)(p0.05)。另外,實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示miR-9和miR-204在定植于胰腺的BMSCs中的表達(dá)高于野生型BMSCs和GFP+ BMSCs(分別為5.2-fold和2.6-fold, p0.05)。miR-375在定植于胰腺的BMSCs中表達(dá)降低(0.71-fold, p0.05),而niR-34a的表達(dá)沒有明顯改變。 2.HE染色顯示蛙皮素處理8周后出現(xiàn)典型慢性胰腺炎特征,免疫組化的結(jié)果顯示GFP廣泛表達(dá)于纖維化胰腺的實(shí)質(zhì)和間質(zhì)中,免疫熒光雙染共聚焦技術(shù)顯示GFP+BMSCs分化為胰腺星狀細(xì)胞(GFP+/Desmin+和GFP+/α-SMA+)(占7.5±2.3%),部分GFP+BMSCs表達(dá)MMP-2和MMP-9。Image Pro Plus軟件檢測天狼星紅染色的胰腺切片,發(fā)現(xiàn)接受GFP+ BMSCs注射的慢性胰腺炎小鼠的纖維化面積占4.56%±0.63%,小于未接受GFP+ BMSCs注射的慢性胰腺炎小鼠(7.37%±0.92%, P 0.05)。Western blotting結(jié)果顯示接受BMSCs處理的胰腺組織中MMP-2和MMP-9的表達(dá)高于未接受BMSCs處理的胰腺組織。 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：相對于慢性胰腺炎大鼠胰腺,miR-34a在PanIN-1, PanIN-2, PanIN-3和PDAC病變組織中表達(dá)顯著升高(p0.05),miR-204在PanIN-2, PanIN-3和PDAC病變組織中表達(dá)顯著降低(p0.05),miR-21在PanIN-3和PDAC病變組織中表達(dá)顯著升高(p0.05),而miR-107只在PDAC病變組織中表達(dá)升高(p0.05)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 1.外周血中的BMSCs能遷移到損傷的胰腺中,并能通過分化為胰腺導(dǎo)管細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞和胰腺星狀細(xì)胞參與胰腺的損傷修復(fù),促進(jìn)胰腺再生。miR-9, miR-204和miR-375可能參與BMSCs在胰腺中的分化過程。 2.外周血中的BMSCs能遷移到纖維化的胰腺中,能通過表達(dá)MMP-2和MMP-9降低胰腺的纖維化程度,同時(shí)也能分化為胰腺星狀細(xì)胞參與纖維化形成過程。 3. miR-34a和miR-204能早期鑒別大鼠的慢性胰腺炎與PanINs病變,可能參與胰腺癌的早期癌變過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R-332

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本文編號：1740305