本文選題：福氏志賀氏菌2a + waaI　； 參考：《南昌大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：志賀氏菌屬(Shigella Spp.)是引起人類細(xì)菌性痢疾的病原菌,通過Ⅲ型系統(tǒng)分泌蛋白至人類細(xì)胞中,導(dǎo)致炎癥應(yīng)答。痢疾是一種世界范圍內(nèi)高發(fā)病率的腸道傳染病,據(jù)保守估計(jì),每年導(dǎo)致全世界死亡人數(shù)超過一百萬例。 目前痢疾的主要治療方式是抗生素療法,并導(dǎo)致高達(dá)95%的臨床分離株對(duì)多種抗生素有耐藥性�？股貫E用引起的細(xì)菌抗藥性已成為治療痢疾感染的難題。最近,在空腸彎曲桿菌((Campylobacter jejuni)中發(fā)現(xiàn)了首個(gè)細(xì)菌N-糖基化(N-glycosylation)途徑,其中該途徑關(guān)鍵酶PglB的發(fā)現(xiàn),對(duì)糖蛋白疫苗的研發(fā)具有里程碑式意義。 細(xì)菌N-糖基化途徑與脂多糖合成相似,均在脂載體上合成寡糖鏈前體,寡糖鏈前體經(jīng)翻轉(zhuǎn)至周質(zhì)空間后,或者由寡糖基轉(zhuǎn)移酶PglB轉(zhuǎn)移到其蛋白底物上,或者先經(jīng)多聚化為O-PS后,再被O-抗原連接酶WaaL連接到類脂A-核心寡糖上形成LPS。利用兩種途徑的相似性：若缺失催化dTDP-鼠李糖合成的基因rfbA,將可以聚合形成O-PS的寡糖鏈前體破壞,蛋白有可能受影響而不能被糖基化；若將O-PS來代替C.jejuni中的七糖前體,將寡糖基轉(zhuǎn)移酶PglB和其蛋白底物克隆到O-抗原連接酶WaaL失活的菌中,即可能獲得連接有O-PS的N-連接糖蛋白。本研究利用兩途徑的相似性對(duì)探究志賀氏菌內(nèi)潛在糖蛋白和獲得針對(duì)志賀氏菌的糖-蛋白綴合物疫苗兩方面展開研究。 在本文中,采用改進(jìn)的λ-Red重組系統(tǒng),成功構(gòu)建了福式2a志賀氏菌301waaⅠ缺失突變株和rfbA缺失突變株,同時(shí)利用低拷貝質(zhì)粒成功構(gòu)建了waaⅠ回復(fù)株。對(duì)這三個(gè)菌株和野生株進(jìn)行LPS銀染實(shí)驗(yàn)進(jìn)行表型鑒定,發(fā)現(xiàn)缺失waaⅠ和rfbA,均影響了LPS合成,在凝膠中未形成一長串的梯狀條帶。接著,對(duì)所構(gòu)建的菌株進(jìn)行生理生化特征研究,并進(jìn)行豚鼠角膜實(shí)驗(yàn)來檢測毒力。結(jié)果表明：waaⅠ (?)口rfbA的缺失對(duì)菌體的生長影響不大；相比于野生株,waaⅠ突變株利用棉子糖的能力降低。在豚鼠角膜實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)waaⅠ (?)口rfbA的缺失株均不能合成LPS,而影響了志賀氏菌的侵襲力,導(dǎo)致其不能正常侵襲豚鼠角膜的上皮細(xì)胞。隨后制備了野生株和waaⅠ回復(fù)株、waaⅠ缺失突變株以及rfbA缺失突變株的全菌蛋白樣品,進(jìn)行雙向電泳后比較野生株和缺失株的蛋白表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn),waaⅠ缺失株、rfbA缺失株與野生株相比有蛋白表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的差異。隨后,將acrA和pglB成功克隆至waaⅠ缺失株中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,AcrA蛋白得到了表達(dá),而PglB蛋白不能正常表達(dá),但未發(fā)現(xiàn)AcrA蛋白糖基化。
[Abstract]:Shigella Spp.It is the pathogen that causes human bacillary dysentery. It secretes proteins into human cells through type 鈪，

本文編號(hào)：1736524