本文選題：家蠶濃核病毒 + 人博卡病毒　； 參考：《華中師范大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：導(dǎo)致人類疾病的病原體在不斷進(jìn)化,人類生產(chǎn)方式和生活環(huán)境的巨大演變也加速著這一進(jìn)化過程。新病毒以及新型疾病的出現(xiàn)給人類生命健康和傳統(tǒng)疾病治療手段帶來了前所未有的挑戰(zhàn),如2003年在亞洲急劇流行的嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)、2009年席卷全球的甲型流感病毒(H1N1、H5N1)和2005年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)小病毒科人博卡病毒(HBoV)等。在眾多威脅人類健康的疾病之中,惡性腫瘤(又稱癌癥)依舊占據(jù)著主要地位,并且尚無切實(shí)可行的治療方法。 尋找可行的癌癥治療手段和方法,已經(jīng)引起了醫(yī)學(xué)界和科學(xué)界的密切關(guān)注,人們不斷探索著一些新的治療方法。相對于傳統(tǒng)癌癥治療手段(化療、放療)所帶來的嚴(yán)重副反應(yīng)特性,近年來出現(xiàn)的生物納米技術(shù)在癌癥治療方面展現(xiàn)出了巨大潛力和優(yōu)勢。納米生物技術(shù)是運(yùn)用一些納米顆粒或類似于納米顆粒的生物材料(如病毒樣顆粒)作為載體平臺(tái),來實(shí)現(xiàn)對病變等非正常細(xì)胞的特異性進(jìn)攻,以達(dá)到治療疾病的目的。目前,有關(guān)病毒樣顆粒在細(xì)胞內(nèi)或生物機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑與機(jī)制、病毒樣顆粒體外去組裝與重組裝、生物效應(yīng)分子的偶聯(lián)與包被等特性尚不夠清楚。 本研究基于已有有關(guān)細(xì)小病毒的研究,體外構(gòu)建家蠶濃核病毒伊那株(BmDNV-1)結(jié)構(gòu)蛋白基因vp4與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白egfp基因融合表達(dá)載體,利用重組桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng),制備熒光病毒樣顆粒(fluorescent virus-like particle, fVLP)。得到的熒光病毒樣顆粒因攜帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記,可以方便地用于其入胞、轉(zhuǎn)運(yùn)、定位以及體外自組裝等生物學(xué)特性研究,為有關(guān)癌癥治療藥物的研發(fā)提供參考。另外,以人博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV-1)結(jié)構(gòu)蛋白VP2為研究對象,構(gòu)建VP2原核表達(dá)載體,親和純化VP2蛋白,用于多克隆抗體制備,用于人博卡病毒的快速檢測和病毒蛋白亞細(xì)胞定位研究。 完成的工作包括以下幾個(gè)方面： 1.制備家蠶濃核病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP4與EGFP融合表達(dá)的熒光病毒樣顆粒 1)PCR分別體外擴(kuò)增家蠶濃核病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因vp4和綠色熒光蛋白egfp基因,通過酶切、連接和轉(zhuǎn)化等步驟篩選重組克隆。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac,在協(xié)助質(zhì)粒的幫助下,構(gòu)建含結(jié)構(gòu)基因vp4和egfp基因融合表達(dá)的重組Bacmid。 2)重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生重組桿狀病毒,獲得重組桿狀病毒病毒液。以最適感染復(fù)數(shù)的病毒液感染hi5細(xì)胞以表達(dá)熒光病毒樣顆粒EGFP-VP4fVLP,然后利用蔗糖墊層及CsCl梯度離心獲得較純凈的fVLP,電鏡觀察。 2.表達(dá)并純化HBoV-1結(jié)構(gòu)蛋白VP2 1)PCR擴(kuò)增HBoV結(jié)構(gòu)蛋白基因vp2,并將其分別連接到pET-28a(+)和pMAL-c2x原核表達(dá)載體上,獲得原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a(+)-VP2和pMAL-c2x-VP2,將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入相應(yīng)表達(dá)宿主菌,檢測目的蛋白VP2表達(dá)情況。 2)將不同分子伴侶導(dǎo)入重組表達(dá)菌,檢測目的蛋白的可溶性及表達(dá)情況,利用親和樹脂純化VP2蛋白,純化獲得的VP2蛋白應(yīng)用于多克隆抗體的制備。
[Abstract]:Lead to human pathogens in the evolution of the great evolution of human mode of production and living environment is also accelerating the process of evolution. The emergence of new viruses and new diseases brought hitherto unknown challenge to human life and health and the traditional means of treatment of diseases, such as the 2003 rapidly popular in Asia the severe acute respiratory syndrome (SARS), 2009 the global influenza A virus (H1N1, H5N1) and Boka discovered in 2005, human parvovirus virus (HBoV). In many diseases threatening human health, malignant tumor (also called cancer) still occupy the main position, and there is no feasible treatment method.
The search for cancer treatment and feasible method, pay close attention to the medical and scientific community, people have been exploring some new methods of treatment. Compared with traditional cancer treatments (chemotherapy, radiotherapy) with serious side effects caused by the bio nanotechnology emerged in recent years in the treatment of cancer has shown a great the potential and advantage. Nano biotechnology is the use of some nano particles or biological materials similar to nano particles (such as virus like particles) as the carrier platform, to realize the specificity of the abnormal cells attack, in order to achieve the purpose of treating disease. At present, the virus like particles in cells or biological pathway the machine body and the mechanism of virus like particles in vitro assembly and re assembly, coupling and package molecules are characteristic of biological effects are still not clear.
This study is based on the research on parvovirus has been constructed in vitro of Bombyx mori Densovirus Iran that strains (BmDNV-1) fusion structure protein gene VP4 and enhanced green fluorescent protein expression vector of EGFP gene, eukaryotic expression system using recombinant baculovirus, preparation of fluorescent virus like particles (fluorescent virus-like, particle, fVLP) fluorescent virus. Like particles derived from carrying green fluorescent protein, can be used conveniently for the entry, transit, self-assembled on the biological characteristics of localization and in vitro, which provide the reference for the research on cancer treatment drugs. In addition, the Boka virus (Human Bocavirus HBoV-1) structural protein VP2 as the research object, construct VP2 the prokaryotic expression vector for VP2 protein, affinity purification, polyclonal antibody preparation, research of rapid detection and virus protein subcellular localization for Boka virus.
The work completed includes the following aspects:
1. preparation of fluorescent virus like particles fused by VP4 and EGFP in silkworm Bombyx mori
1) PCR respectively in vitro amplification of Bombyx mori densonucleosis virus structural protein VP4 Gene and green fluorescent protein EGFP gene by restriction enzyme digestion, ligation and transformation steps of screening recombinant cloning. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli DH10Bac, to assist with the help of the recombinant plasmid, the expression of Bacmid. fusion gene containing VP4 and EGFP gene structure
2) the expression of recombinant Bacmid transfected Sf9 insect cells to produce recombinant baculovirus recombinant baculovirus virus. In order to liquid fluorescence expression of virus like particles of EGFP-VP4fVLP cells infected with hi5 virus was the optimal multiplicity of infection, and then using sucrose gradient and CsCl gradient centrifugation to obtain pure fVLP and electron microscopy.
2. expression and purification of HBoV-1 structural protein VP2
1) PCR amplified the HBoV structural protein gene VP2 and connected it to pET-28a (+) and pMAL-c2x prokaryotic expression vector respectively. The prokaryotic expression plasmid pET-28a (+) -VP2 and pMAL-c2x-VP2 were obtained. The recombinant plasmids were transferred into the corresponding host bacteria respectively, and the target protein VP2 status was detected.
2) introduce different molecular chaperones into recombinant expression bacteria, detect the solubility and expression of target protein, purify VP2 protein with affinity resin, and purify VP2 protein, and prepare polyclonal antibody.

【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R373

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本文編號：1735043