本文選題：小鼠白細(xì)胞介素- + 重疊延伸PCR　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》2017年02期

【摘要】：目的:制備重組小鼠白細(xì)胞介素-27(interleukin-27,IL-27)融合蛋白的多克隆抗體并鑒定其活性。方法:用反轉(zhuǎn)錄PCR從小鼠脾細(xì)胞擴(kuò)增出EB病毒誘導(dǎo)基因3(EBI3)和p28成熟肽基因片段,采用重疊延伸PCR用(Gly4Ser)3接頭將2個(gè)片段進(jìn)行連接,將得到的小鼠IL-27單鏈融合基因片段克隆于p ET-32a(+)載體。陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),利用SDS-PAGE與Western blot鑒定目的蛋白的表達(dá)。以純化的IL-27融合蛋白免疫新西蘭大白兔,制備兔抗小鼠IL-27融合蛋白的多克隆抗體,利用Western blot和ELISA進(jìn)行特異性及效價(jià)分析。結(jié)果:從小鼠脾細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增得到IL-27單鏈融合基因經(jīng)測(cè)序與預(yù)期序列一致;在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE顯示表達(dá)出的融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量(molecular weight,Mr)約67 000;Western blot結(jié)果表明該融合蛋白能與抗6×His的單克隆抗體發(fā)生反應(yīng);該蛋白免疫新西蘭大白兔后獲得抗血清,Western blot結(jié)果顯示該血清可以特異性地與IL-27融合蛋白結(jié)合,ELISA測(cè)定該多克隆抗體的效價(jià)可以達(dá)到1∶3 200。結(jié)論:在大腸桿菌中成功表達(dá)出小鼠IL-27融合蛋白,并制備出效價(jià)較高、特異性較好的兔抗小鼠IL-27多克隆抗體。
[Abstract]:Aim: to prepare the polyclonal antibody against recombinant mouse interleukin-27 interleukin-27 (IL-27) fusion protein and to identify its activity.Methods: Epstein-Barr virus inducible gene (EBI3) and p28 mature peptide gene fragments were amplified from mouse spleen cells by reverse transcription PCR. The two fragments were ligated by overlapping extension PCR using Gly4Serf3 junction.The single strand fusion gene fragment of mouse IL-27 was cloned into pET-32a () vector.Positive recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) and isopropylthio- 尾 -Dgalactoside (IPTG) induced the expression of fusion protein. The expression of the target protein was identified by SDS-PAGE and Western blot.The polyclonal antibody of rabbit anti-mouse IL-27 fusion protein was prepared by immunizing New Zealand white rabbits with purified IL-27 fusion protein. The specificity and titer of Western blot and ELISA were analyzed.Results: the single strand IL-27 fusion gene was sequenced from the total RNA of mouse spleen cells, and the sequence was consistent with the expected sequence.IPTG induced SDS-PAGE showed that the fusion protein could react with monoclonal antibody against 6 脳 His. The relative molecular weight of the fusion protein was about 67000 blot. The results showed that the fusion protein could react with the monoclonal antibody (McAb) of 6 脳 His in E. coli BL21DDE3. The results showed that the fusion protein could react with the monoclonal antibody of 6 脳 His.After immunizing New Zealand white rabbits, the antiserum was obtained by Western blot. The results showed that the antibody titer of the polyclonal antibody could reach 1:3 200 by Elisa with IL-27 fusion protein binding protein.Conclusion: mouse IL-27 fusion protein was successfully expressed in Escherichia coli and rabbit polyclonal antibody against mouse IL-27 was prepared with higher titer and better specificity.
【作者單位】： 濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系;濰坊醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):81170080、81470001) 濰坊醫(yī)學(xué)院2011年科技創(chuàng)新前沿探索重點(diǎn)研究資助項(xiàng)目(編號(hào):K11TS1004)
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1732971