本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點：miRNA　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：軟骨缺損一直是外科修復(fù)治療的難題,組織工程學(xué)能夠結(jié)合細(xì)胞學(xué)和工程學(xué)原理對受損組織進(jìn)行生理性修復(fù),是一種理想的修復(fù)方法。由于其自身優(yōu)勢,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)被認(rèn)為是目前軟骨組織工程較理想的種子細(xì)胞,如何調(diào)控MSCs定向分化成軟骨細(xì)胞是目前軟骨組織工程學(xué)中的重要問題。然而,MSCs成軟骨分化的精確分子調(diào)控機(jī)制還未完全闡明,因此探求MSCs成軟骨分化的調(diào)控機(jī)制,有可能為探索切實有效的促分化策略提供基礎(chǔ),同時也有益于推進(jìn)組織工程軟骨在臨床的應(yīng)用前景。近年一些研究證實,microRNA(miRNAs)在干細(xì)胞的干性維持和分化中具有重要的功能。與越來越復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)和蛋白網(wǎng)絡(luò)相比,miRNAs表達(dá)特征譜作為一種新的強(qiáng)有力的工具,在組織器官的定向發(fā)育、細(xì)胞生長和分化的時空調(diào)節(jié)、信號通路的開啟和關(guān)閉及疾病治療靶點確定的研究中更具獨特優(yōu)勢。探討miRNAs在MSCs成軟骨分化中的作用機(jī)制,將為進(jìn)一步理解MSCs成軟骨分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的視角。 本課題擬從三個部分的實驗研究對miRNAs介導(dǎo)的調(diào)控MSCs成軟骨分化的生物學(xué)功能及分子機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的探討。 1.利用小鼠骨髓來源MSCs,建立穩(wěn)定的體外誘導(dǎo)成軟骨分化細(xì)胞模型。通過miRNA芯片技術(shù)獲得小鼠MSCs成軟骨分化不同階段的miRNA表達(dá)譜,并以定量PCR實驗對芯片結(jié)果進(jìn)行驗證。再結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測軟件和定量PCR實驗分析miRNA的靶基因,篩選出參與調(diào)控MSCs成軟骨分化的候選靶基因。 2.結(jié)合生物信息學(xué)實驗和雙熒光素酶報告基因檢測,驗證候選miRNA作用于預(yù)測靶基因結(jié)合位點的真實性。 3.利用C3H10T1/2誘導(dǎo)成軟骨分化細(xì)胞模型,檢測針對候選miRNA的gain-of-function和loss-of-function干預(yù)實驗中,各種軟骨特異性標(biāo)志表型的表達(dá)變化,證實候選miRNA調(diào)控MSCs成軟骨分化的生物學(xué)效應(yīng)。同時,以定量PCR和Western blot實驗探索候選miRNA調(diào)節(jié)靶基因的作用機(jī)制。 通過上述三部分實驗,研究結(jié)果顯示: 1.通過直接貼壁法能夠獲得增殖能力強(qiáng),MSCs標(biāo)志CD分子表型一致,并具備多向分化能力(成骨分化、成脂分化和成軟骨分化)的小鼠骨髓來源MSCs�；诖朔椒ǚ蛛x的MSCs,我們選取了MSCs成軟骨分化不同階段的細(xì)胞進(jìn)行miRNA芯片掃描,包括:微團(tuán)培養(yǎng)的P3 MSCs,MSCs誘導(dǎo)成軟骨分化7d,MSCs誘導(dǎo)成軟骨分化14d,單層培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞。結(jié)果在MSCs成軟骨過程中,表達(dá)發(fā)生顯著性改變的miRNAs有13個(8個上調(diào),5個下調(diào))。其中,miR-143/145和miR-132/212作為miRNA功能簇,在此進(jìn)程中表達(dá)逐步下調(diào)。qPCR驗證其中4個miRNAs的表達(dá),與芯片結(jié)果一致,反映了芯片結(jié)果的可靠性。定量PCR結(jié)果顯示,4個生物信息學(xué)預(yù)測差異表達(dá)的miRNAs的軟骨相關(guān)靶基因在此進(jìn)程中的表達(dá)模式與相應(yīng)的miRNA表達(dá)模式呈相反趨勢。提示這些差異表達(dá)的miRNAs可能參與調(diào)控MSCs成軟骨分化。 2.生物信息學(xué)預(yù)測,調(diào)控軟骨形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Sox9及其協(xié)同效應(yīng)分子RelA分別是miR-145和miR-143的靶基因。為了驗證其預(yù)測作用靶位點的真實性,我們分別成功構(gòu)建了針對miR-145和miR-143的陽性對照熒光報告載體(pMIR-PT),包含預(yù)測靶位點的實驗熒光報告載體(pMIR-MRE)和包含亂序排列的預(yù)測靶位點的實驗熒光報告載體(pMIR-MUT)。雙熒光素酶報告基因證實,miR-145能與Sox9的3’-UTR上預(yù)測靶位點有效結(jié)合,發(fā)揮抑制效應(yīng)。結(jié)合miRNA芯片結(jié)果顯示miR-145在誘導(dǎo)MSCs成軟骨分化中的顯著下調(diào)趨勢,進(jìn)一步提示miR-145有可能通過調(diào)節(jié)靶基因Sox9,參與調(diào)控MSCs成軟骨分化進(jìn)程。另一方面,miR-143的作用方式則不同于我們預(yù)期,我們僅得到了miR-143作用于RelA預(yù)測靶位點的陰性結(jié)果,其在MSCs成軟骨分化中的作用有待于獨立的實驗再次探索。 3.在C3H10T1/2誘導(dǎo)成軟骨分化細(xì)胞模型中,miR-145過表達(dá)能抑制Sox9下游靶基因,同時也是軟骨形成特征型表型基因(Col2a1、Agc1、COMP、Col9a2、Col11a1)的mRNA表達(dá)。相反,抑制miR-145表達(dá)則顯著促進(jìn)上述基因mRNA表達(dá)。同時, miR-145過表達(dá)能抑制細(xì)胞分泌軟骨特征型細(xì)胞外基質(zhì)GAGs。相反,抑制miR-145表達(dá)則顯著提升GAGs形成。另外,miR-145僅在蛋白水平調(diào)節(jié)靶基因Sox9的表達(dá)。另一方面,無論過表達(dá)或抑制miR-145表達(dá),均對Sox9下游非軟骨形成相關(guān)特異性靶基因(C/EBPδ、C/EBPβ)的mRNA表達(dá)沒有影響。進(jìn)一步關(guān)于細(xì)胞增殖的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-145的改變并未對細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。研究結(jié)果證實miR-145調(diào)控MSCs成軟骨分化的作用效應(yīng),其作用機(jī)制是以轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)Sox9表達(dá),從而特異性參與調(diào)控MSCs成軟骨分化。 綜上所述,本課題成功分離、培養(yǎng)小鼠骨髓來源MSCs,建立穩(wěn)定的體外誘導(dǎo)MSCs成軟骨分化的細(xì)胞模型。通過miRNA芯片技術(shù)首次獲得小鼠MSCs成軟骨分化4個不同階段的miRNA表達(dá)譜,并經(jīng)定量PCR驗證了部分結(jié)果;篩選出與軟骨形成相關(guān)候選miRNAs。驗證了miR-145作用于Sox9的3’-UTR靶位點的真實性。同時也證實了RelA并非miR-143的靶基因。證實在TGF-β3驅(qū)動的MSCs成軟骨分化中,miR-145表達(dá)下調(diào)能有效促進(jìn)MSCs向軟骨細(xì)胞系定向分化,其調(diào)控機(jī)制是通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)Sox9蛋白表達(dá),從而以Sox9為重要介導(dǎo)因子,特異性參與調(diào)控MSCs成軟骨分化進(jìn)程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1729707