本文選題：肝再生　切入點：基因表達調(diào)控　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：肝臟是一種具有極強再生能力的器官之一。雖然肝細胞屬于終末分化細胞，一般情況下都處于靜止狀態(tài)，很少增殖。但是在出現(xiàn)肝臟損傷的情況，如肝臟部分切除、化學(xué)性或病毒性肝損傷、肝臟腫瘤等原因造成肝臟細胞損傷、壞死和肝細胞功能超載，都可以立即誘發(fā)和啟動肝細胞增殖和肝臟再生過程。肝再生過程大致可以分為三個階段：早期階段（啟動期），中期階段（增殖期）和晚期階段（終止期）。以往的研究熱點多關(guān)注于單個信號分子，，重要轉(zhuǎn)錄因子以及相關(guān)靶基因和信號通路的研究；此外，也有部分基于蛋白質(zhì)組、mRNA表達譜的組學(xué)研究。但這些常規(guī)研究方法對肝再生基因表達調(diào)控機制的闡明有限，不能全面解析肝再生過程中差異基因表達調(diào)控的分子機制。因此，本課題主要從微小RNA（microRNA）和轉(zhuǎn)錄因子這兩個具有不同調(diào)控主體的層面，對肝再生過程中基因表達調(diào)控的分子機制進行探討。 第一部分肝再生中microRNA表達譜篩選及差異microRNA的功能研究 近年來關(guān)于非編碼小RNA（non-coding small RNA）的研究進展使我們對于腫瘤等多種與增殖、分化相關(guān)的疾病有了新的認識。microRNA（miRNA）是一組生物體基因組編碼的內(nèi)源的非編碼小RNA。這一類RNA分子可以在轉(zhuǎn)錄后水平對其靶基因進行調(diào)控（如降解mRNA或抑制mRNA翻譯），由于被調(diào)控靶基因涉及生命過程各個方面，所以microRNA在細胞增殖、生長、分化、腫瘤發(fā)生等過程中起著非常重要的調(diào)控作用。新近研究提示，microRNA還可能參與了肝癌和肝再生過程。為探討miRNA在肝再生過程中的變化規(guī)律及生物學(xué)功能，本課題運用microRNA微陣列和實時定量PCR技術(shù)在大鼠和小鼠的肝再生模型中初步篩選和驗證了顯著差異表達microRNA。我們的研究顯示：在肝再生早期miR-376b，miR-494及miR-127，均顯著下調(diào)；在肝再生晚期miR-34a以約5倍的差異上調(diào)最為顯著。隨后，我們分別在大鼠或小鼠肝再生模型中對miR-34a，miR-376b和miR-494進行后續(xù)靶基因和功能研究。 miR-34a功能研究：通過體外實驗，我們證實miR-34a能顯著抑制肝細胞增殖，并且影響肝細胞周期。隨后，我們在細胞學(xué)水平通過qRT-PCR，westernblot和熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CMet和inhibin βB (INHBB)，證實它們受miR-34a調(diào)控。INHBB-si-RNA干擾實驗提示INHBB可能是一個細胞增殖促進因子。因此，我們推測在肝再生晚期，它可能受miR-34a調(diào)控而下調(diào)，從而有助于肝細胞增殖終止。同時，我們檢測到在肝再生晚期INHBB和Met顯著下調(diào)，提示它們在體內(nèi)也受miR-34a調(diào)控。最后，通過染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）-PCR實驗，我們發(fā)現(xiàn)肝再生晚期miR-34a的上調(diào)與P53密切相關(guān)。 miR-376b和miR-494的功能研究：miR-376b和miR-494都位于小鼠12號染色體的DLK1-GTL2印記區(qū)域內(nèi)，提示肝再生早期DLK1-GTL2印記域內(nèi)的miRNA簇有共同的調(diào)控機制和變化趨勢。通過體外增殖實驗，我們證實miR-376b和miR-494均能顯著抑制肝細胞增殖。隨后，我們聯(lián)合運用miRNA預(yù)測靶基因（生物信息學(xué)預(yù)測）-差異表達蛋白質(zhì)（定量蛋白質(zhì)組學(xué)）相結(jié)合的方法尋找潛在靶基因。最后通過miRNA模擬物和qRT-PCR的方法，我們推測miR-376b和miR-494可能分別通過相應(yīng)靶基因影響肝細胞增殖或凋亡。 第二部分小鼠肝再生早期轉(zhuǎn)錄因子活性譜及轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究 由于目前國際上尚未見在肝再生研究領(lǐng)域?qū)D(zhuǎn)錄因子活性譜進行高通量篩選的報道。因此，本課題首次在肝再生模型中運用轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片（同時檢測約200個轉(zhuǎn)錄因子活性）對小鼠肝再生早期變化的轉(zhuǎn)錄因子進行高通量篩選，得到了16個活性上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子，1個活性顯著下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子，其中包括上游激活轉(zhuǎn)錄因子1（upstream stimulatory transcription factor1，USF1）在內(nèi)的多個轉(zhuǎn)錄因子尚未見在肝再生中的報道。因此，本課題以篩選的轉(zhuǎn)錄因子USF1為研究重點，通過染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合芯片（ChIP-on-chip），肝再生早期全基因組表達譜以及生物信息學(xué)等研究手段，構(gòu)建小鼠肝再生早期以USF1為核心的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；最后我們通過ChIP實驗驗證了早期肝再生組織中USF-1與多個轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控靶基因的現(xiàn)象。 基于上述分析，本課題利用經(jīng)典的大鼠或小鼠70%肝切除術(shù)后的肝再生模型，研究肝再生過程中的microRNA表達譜和差異microRNA，轉(zhuǎn)錄因子活性譜和差異轉(zhuǎn)錄因子，并探討相關(guān)分子機制。本研究將有利于豐富對肝再生過程中基因表達調(diào)控機制的研究，為肝癌、肝硬化、病毒性肝炎等肝臟疾病的治療提供分子機理的理論和實驗依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【共引文獻】

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本文編號：1724615