本文選題：精子　切入點：獲能　出處：《第三軍醫(yī)大學》2012年博士論文

【摘要】：新鮮射出的精子在進入雌性生殖道內，發(fā)生一系列的生物化學改變從而獲得受精能力的過程，稱為精子獲能[1]。包括精子質膜流動性增加，膽固醇外流，離子流動，酪氨酸磷酸化蛋白增多，精子超激活運動以及頂體反應的誘導等。PKA作用下的蛋白酪氨酸磷酸化是一重要的翻譯后修飾事件，是精子獲能的一個重要標志。目前的研究仍未解釋清楚PKA信號機制，以及PKA作用的底物蛋白。 已發(fā)現的與纖維鞘有關的蛋白有20余種，包括AKAP3，AKAP4, TAKAP-80；GAPDS，HK1-S，GSK3β，ALDOA，LDHA；SFEC，磷酸甘油醛異構酶，GAPDH，丙酮酸激酶，LDH-C，山梨醇脫氫酶；GSTM5；FS39；Ropporin；Rhophilin；SP17; PDE4A;FSIP1和FSIP2; ASP，CABYR等。但是目前的研究仍未完全闡明精子獲能過程中PKA的底物蛋白及其作用機制。 我們課題組最近發(fā)現了一種特異性表達于鼠精子尾部纖維鞘表面的全新蛋白FSCB[2]，前期的研究表明該蛋白可與另一種精子鞭毛上具有鈣結合功能和在精子獲能過程中可被酪氨酸磷酸化的精子特異性CABYR蛋白[3]結合，其本身也具有鈣結合能力，在體外可被蛋白激酶A磷酸化。FSCB具有保守的PXXP基序，脯氨酸富積區(qū)和伸展蛋白樣區(qū)域。FSCB在精子上的超微結構定位研究顯示其位于精子鞭毛纖維鞘縱形柱狀體和環(huán)狀肋板表面的中等電子密度皮質層。鑒于該蛋白與某些精子纖維鞘蛋白如AKAP3，AKAP4，CABYR等具有相似的定位特征，而且具有可被磷酸化及與鈣結合的功能特性，推測該蛋白可能是一種參與精子鞭毛的運動，與精子獲能和超活化作用有關的重要蛋白。 本課題為進一步探討FSCB基本生物學特性，研究了該蛋白在精子的獲能過程中是否被PKA磷酸化以及DB-CAMP和H-89對該蛋白磷酸化、PKA活性和精子運動特征的影響。整個課題研究分為三個部分進行。 一、精子獲能過程中FSCB可被PKA磷酸化并發(fā)生酪氨酸磷酸化 我們的前期研究發(fā)現FSCB可在體外被PKA催化亞單位磷酸化，并存在多個磷酸化位點。為進一步研究FSCB在精子獲能過程中是否發(fā)生磷酸化，，我們取成年雄性昆明小鼠（12-16周）精子于HTF（獲能培養(yǎng)液）與M2（非獲能培養(yǎng)液）分別培養(yǎng)2h，取等量樣品進行裂解，蛋白定量，一維電泳后，用抗磷酸化PKA底物抗體進行Western blot分析，一抗同源免疫前血清做陰性對照。結果發(fā)現獲能培養(yǎng)液培養(yǎng)2h精子裂解產物在270Kda處出現清晰陽性條帶，而未獲能培養(yǎng)液以及陰性對照中不出現免疫印跡條帶。 為驗證該條帶是否是FSCB以及該蛋白是否在精子獲能過程中發(fā)生了磷酸化，我們進一步分別用抗磷酸化PKA底物抗體、抗磷酸化酪氨酸抗體、抗FSCB抗體進行小鼠獲能與未獲能精子免疫沉淀，沉淀產物用抗FSCB抗體進行Western blot驗證，一抗同源免疫前血清做陰性對照。結果在獲能后精子中，應用抗磷酸化PKA底物抗體、抗磷酸化酪氨酸抗體以及FSCB抗體免疫沉淀產物用FSCB抗體進行Western blot分析均在270Kda處出現陽性條帶，而未獲能精子中，應用抗磷酸化PKA底物抗體、抗磷酸化酪氨酸抗體的免疫沉淀產物未出現上述陽性條帶，該條帶僅出現于FSCB抗體免疫沉淀產物中。表明該270Kda蛋白即為FSCB，而且提示FSCB被PKA磷酸化，同時，其酪氨酸亦發(fā)生磷酸化。 為研究FSCB磷酸化程度與精子獲能時間之間的關系，我們進一步于不同時相點（1,2,5,10,30,60, min和120min）取等量HTF培養(yǎng)液中精子樣品進行裂解，繼續(xù)用抗磷酸化PKA底物抗體進行Western blot分析。發(fā)現該條帶最早出現于接觸獲能培養(yǎng)液的1min，且隨時間延長不斷加深，60min后保持不變。結果表明FSCB在精子獲能過程中可被PKA磷酸化，也可發(fā)生其酪氨酸的磷酸化，其磷酸化程度與接觸獲能培養(yǎng)液時間密切相關。 二、PKA活性影響FSCB磷酸化 FSCB作為PKA的作用底物之一，在精子獲能過程中可以被PKA磷酸化。研究PKA活性改變對FSCB磷酸化狀態(tài)的影響，對進一步闡明精子獲能過程蛋白磷酸化的分子基礎和調節(jié)機制顯得十分重要。我們分別用H-89和DB-cAMP處理小鼠精子，觀察FSCB磷酸化狀態(tài)的改變。取等量精子于HTF培養(yǎng)液、含0.5μM H-89的HTF培養(yǎng)液、M2培養(yǎng)液和含2.5mM DB-cAMP的M2培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，分別于不同時相點（1,2,5,10,30,60, min和120min）取等量小鼠精子進行PKA活性分析，并于30分鐘取不同培養(yǎng)液中精子樣品裂解，蛋白定量后用抗磷酸化PKA底物抗體進行Western blot分析，一抗同源免疫前血清做陰性對照。 實驗中我們發(fā)現向HTF培養(yǎng)液中添加0.5μM H-89后，PKA活性受到明顯抑制，向M2培養(yǎng)液中添加2.5mM DB-cAMP后，PKA活性顯著增強。用抗磷酸PKA底物抗體Western blot分析HTF培養(yǎng)液、含2.5mM DB-cAMP的M2培養(yǎng)液30min精子裂解液在270KD處出現陽性條帶，而在含0.5μM H-89的HTF培養(yǎng)液、M2培養(yǎng)液精子裂解液中無陽性條帶。結果表明H-89可抑制PKA活性，DB-CAMP則增強PKA活性，二者可通過改變PKA活性從而影響FSCB的磷酸化。 三、FSCB磷酸化程度與精子運動功能密切相關 特定蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化是精子獲能的重要標志，與精子運動速度、擺動頻率等運動特征改變相關。為研究FSCB磷酸化與精子運動特征之間的關系，進行了不同時相點精子運動特征分析。我們分別取小鼠精子于HTF培養(yǎng)液、含0.5μM H-89的HTF培養(yǎng)液, M2培養(yǎng)液和含2.5mM DB-cAMP的M2培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，分別于不同時相點（1,2,5,10,20,30,60和120min）取5μl小鼠精子精子活力分析儀（西班牙）分析。 我們發(fā)現向HTF培養(yǎng)液中添加0.5μM H-89后，獲能后1、5、10、20、30、60和120min精子VCL降低明顯，獲能后1、5、10、20、30和60min（A+B）%也顯著下降；向M2培養(yǎng)液中添加2.5mM DB-cAMP后，獲能后1、5、10、20、30min精子VCL明顯增強，獲能后1、5、10、20min（A+B）%也升高明顯。綜合分析上述實驗結果，發(fā)現精子運動特征的變化與FSCB磷酸化水平改變有明顯的線性關系，我們初步得出H-89通過抑制FSCB磷酸化而抑制精子運動，DB-CAMP可促進FSCB磷酸化而促進精子運動。
[Abstract]:Fresh ejaculated sperm into the female reproductive tract, a series of biochemical changes to achieve the fertilization ability of sperm capacitation, known as [1]. including sperm plasma membrane fluidity increased cholesterol efflux, ion mobility, protein tyrosine phosphorylation increased sperm hyperactivated protein tyrosine phosphorylation induced by.PKA effect and top sports body reaction under is an important post-translational modification events, is an important sign of sperm capacitation. Research has not yet been explained PKA signal mechanism, and the role of PKA protein substrate.
Have been found associated with the fibrous sheath protein more than 20 species, including AKAP3, AKAP4, TAKAP-80; GAPDS, HK1-S, ALDOA, GSK3 beta, LDHA; SFEC, triosephosphate isomerase, GAPDH, pyruvate kinase, LDH-C, sorbitol dehydrogenase; GSTM5; FS39; Ropporin; Rhophilin; SP17; PDE4A; FSIP1 and FSIP2 ASP; CABYR, etc. but the study has not yet been fully elucidated sperm capacitation substrates of PKA protein and its mechanism.
We recently discovered a specific expression in mouse sperm tail fibrous sheath on the surface of a new protein FSCB[2], previous studies have shown that the protein and calcium binding function in sperm capacitation by sperm specific CABYR protein tyrosine phosphorylation of [3] in combination with another sperm flagellum has its own. Also has the ability of binding calcium in vitro by protein kinase A phosphorylation of.FSCB has a conserved PXXP motif, the ultrastructural localization of proline rich region and protein like region.FSCB in sperm showed its extension in sperm flagella fibrous sheath longitudinal cylindrical body and an annular rib on the surface of the secondary electron density. In view of the cortex the protein and some sperm fibrous sheath protein such as AKAP3, AKAP4, CABYR etc. with positioning similar features, but also has the characteristics of function can be phosphorylated and calcium binding, speculated that the protein may be An important protein that participates in the movement of sperm flagellum, which is related to the effect of sperm capacitation and super activation.
In order to further explore the basic biological characteristics of FSCB, we studied whether the protein was phosphorylated by PKA and the effects of DB-CAMP and H-89 on the protein phosphorylation, PKA activity and sperm motility in the process of sperm capacitation. The whole research is divided into three parts.
First, FSCB can be phosphorylated by PKA and tyrosine phosphorylation during the process of sperm capacitation
Our previous study found that FSCB is the catalytic subunit of PKA phosphorylation in vitro, and the presence of multiple phosphorylation sites. For the further study of FSCB phosphorylation in sperm capacitation is in the process, we take the adult male Kunming mice (12-16 weeks) in HTF (sperm capacitation medium) and M2 (a non can medium) were cultured in 2H, take the same amount of sample lysis, protein, SDS-PAGE, Western blot analysis with anti phospho PKA antibody substrate, a homologous anti pre immune serum as a negative control. Results showed that capacitation of cultured 2H sperm lysates appear clear positive bands at 270Kda, and not to the culture medium and negative western blot bands do not appear in the control.
In order to verify whether the band is FSCB and whether the protein in sperm capacitation occurred in the phosphorylation process, we further respectively with anti phospho PKA substrate antibody, anti phosphotyrosine antibody, anti FSCB antibody in mice and sperm capacitation has not been able to immunoprecipitation, Western blot confirmed by anti FSCB antibody producing precipitation a homologous, anti pre immune serum as a negative control. Results after capacitation, using anti phospho PKA antibody substrate, tyrosine phosphorylation of FSCB antibody and antibody immunoprecipitation products Western blot analysis with FSCB antibody showed positive bands at 270Kda, but can not use anti sperm, P phosphorylation of the PKA substrate antibody, immune antibody against tyrosine phosphorylation of the precipitate does not appear the positive bands, the bands only appeared in FSCB antibody immunoprecipitation products. Showed that the 270Kda protein is FSCB, and the It is suggested that FSCB is phosphorylated by PKA, and its tyrosine is phosphorylated.
For the study of FSCB phosphorylation and capacitation time, we further in different time points (1,2,5,10,30,60, min and 120min) take the same amount of HTF sperm culture liquid samples pyrolysis, continue Western blot analysis with anti phospho PKA antibody. The substrate bands appeared in contact with capacitation the medium 1min, and with the extension of time continues to deepen, remained unchanged after 60min. The results showed that FSCB in sperm capacitation by PKA phosphorylation can occur the tyrosine phosphorylation, the phosphorylation level of contact was closely related to the medium.
Two, PKA activity affects the phosphorylation of FSCB
FSCB as the substrate of PKA, the sperm capacitation can be phosphorylated by PKA process. To study the change of the activity of PKA on the phosphorylation state of FSCB, to further elucidate the molecular basis of sperm capacitation and protein phosphorylation in the regulation mechanism is very important. We use H-89 and DB-cAMP treated mice sperm, observation FSCB the phosphorylation state changes. Take the same amount of HTF medium in sperm, containing 0.5 M H-89 HTF medium, M2 medium and M2 medium containing 2.5mM DB-cAMP were cultured in different time points (1,2,5,10,30,60, min and 120min) take the same amount of mouse sperm for PKA activity analysis, and in 30 minutes cultured for different sample of sperm lysates, Western blot analysis with anti phospho PKA antibody protein substrate, a homologous anti pre immune serum as a negative control.
In the experiment we found to add 0.5 M H-89 HTF culture medium, the activity of PKA was inhibited, M2 cultured with 2.5mM DB-cAMP, PKA activity was significantly enhanced. HTF medium with anti phospho PKA antibody Western substrate blot analysis, DB-cAMP M2 medium containing 2.5mM 30min sperm lysates in 270KD there was a strap and medium containing 0.5 M H-89 HTF, M2 free culture positive band liquid sperm lysates. The results showed that H-89 can inhibit the activity of PKA, DB-CAMP increased the activity of PKA two can change the activity of PKA by affecting the phosphorylation of FSCB.
Three, the degree of FSCB phosphorylation is closely related to sperm motility
Specific protein tyrosine phosphorylation is an important sign of sperm capacitation, sperm motility and velocity, the oscillation frequency of motion characteristics change. In order to study the relationship between FSCB phosphorylation and sperm motion characteristics, the sperm movement characteristics at different time points were taken. We analysis the mouse sperm in HTF culture solution, containing 0.5 M H-89 HTF medium, M2 medium and M2 medium containing 2.5mM DB-cAMP were cultured in different time points (1,2,5,10,20,30,60 and 120min) from 5 L mice sperm motility analyzer (Spain) analysis.
We found HTF to 0.5 M H-89 added to the culture medium, 1,5,10,20,30,60 and 120min after capacitation of sperm VCL decreased significantly after capacitation, 1,5,10,20,30 and 60min (A+B) also decreased to M2%; the medium adding 2.5mM DB-cAMP, 1,5,10,20,30min VCL after capacitation, sperm capacitation significantly enhanced after 1,5,10,20min (A+B%) was also higher. The comprehensive analysis of the experimental results, found that the changes of sperm movement characteristics and the level of FSCB phosphorylation changes have obvious linear relationship, we draw the inhibition of sperm motility by inhibiting the phosphorylation of FSCB and H-89, DB-CAMP can promote FSCB phosphorylation and promote sperm motility.

【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R339.2

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本文編號：1711493