本文選題：血小板　切入點(diǎn)：庫存紅細(xì)胞　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2012年碩士論文

【摘要】：背景 同種異體輸血(allogeneic blood transfusion, ABT)在臨床搶救病人過程中發(fā)揮著重要作用，但同種異體輸血在挽救生命的同時(shí)，也會(huì)并發(fā)很多免疫相關(guān)的副反應(yīng)。輸血相關(guān)免疫調(diào)節(jié)(transfusion-related immunomodulation,TRIM)[1]是輸入同種異體血液導(dǎo)致免疫系統(tǒng)改變的以免疫抑制為特征的綜合征，臨床常見的并發(fā)TRIM導(dǎo)致免疫抑制的嚴(yán)重后果為術(shù)后感染和腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。懸浮紅細(xì)胞在保存過程中，含有的白細(xì)胞及血小板可以釋放多種生物活性物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)的濃度會(huì)隨著保存時(shí)間的延長而升高，當(dāng)這些生物活性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后有可能導(dǎo)致受者免疫狀態(tài)發(fā)生改變，導(dǎo)致TRIM的后果。 TRIM發(fā)生的確切機(jī)制尚不清楚。目前的研究已知，各種刺激信號(hào)必須與其相應(yīng)靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，通過其特定的信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)作用。最近的研究中發(fā)現(xiàn)血小板不僅在止血和凝血過程中發(fā)揮重要作用，血小板還參與了很多炎癥反應(yīng)。血小板是外周血體積最小的血細(xì)胞，由巨核細(xì)胞的胞漿部分脫落形成，含有致密顆粒和α顆粒，激活后可以釋放多種細(xì)胞因子和生長因子，如可溶性CD40配體（sCD40L）、腫瘤壞死因子α （TNF-α）、白細(xì)胞介素1β （IL-1β）、轉(zhuǎn)化生長因子β （TGFβ）、RANTES等。在紅細(xì)胞保存過程中，血小板非常容易活化，從而釋放大量生物活性因子，關(guān)于這些生物活性因子在TRIM中的作用，，國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。目的探討血小板在輸注庫存紅細(xì)胞增強(qiáng)患者炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制。 方法 1.庫存紅細(xì)胞上清制備： 取新鮮采集懸浮紅細(xì)胞3袋，用無菌接合機(jī)與無菌空袋接合混合后，放置在4℃冰箱中保存。分別于7d、21d、35d用無菌接合機(jī)與無菌空袋接合留取樣本，通過4000g離心，將紅細(xì)胞上層液體擠入無菌空袋，得到含有少量紅細(xì)胞的上清，大約130ml。將此上清以無菌的方式倒入無菌EP管中，以10000g離心，以去除紅細(xì)胞，得到紅細(xì)胞上清。將此上清分裝成6分，放入-80℃冰箱保存。 2.實(shí)驗(yàn)分組： 將150ml新采集的機(jī)采血小板用同型血漿稀釋后，用無菌接合機(jī)與血小板保存袋連接擠入40ml血小板，依此方法再重復(fù)12次。任選其中4袋血小板以無菌的方式全部加入7d庫存紅細(xì)胞上清5ml，然后將其中3袋分別以無菌方式加入濃度10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的LPS45ul并標(biāo)記好。再選剩余血小板中4袋血小板以無菌的方式全部加入28d庫存紅細(xì)胞上清5ml，然后將其中3袋分別以無菌方式加入45ul濃度10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的LPS并標(biāo)記好。再選剩余血小板中4袋血小板以無菌的方式全部加入35d庫存紅細(xì)胞上清5ml，然后將其中3袋分別以無菌方式加入45μ l濃度10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的LPS并標(biāo)記好。最后剩下一袋血小板什么都不加，即： A組：對(duì)照組，稀釋后的機(jī)采血小板40ml。 B組：加入5ml7d或21d或35d紅細(xì)胞上清的45ml機(jī)采血小板。 C組：加入5ml7d或21d或35d紅細(xì)胞上清和45μ l濃度為10ng/ml的LPS的機(jī)采血小板45ml。 D組：加入5ml7d或21d或35d紅細(xì)胞上清和45μ l濃度為100ng/ml的LPS的機(jī)采血小板45ml。 E組：加入5ml7d或21d或35d紅細(xì)胞上清和45μ l濃度為1000ng/ml的LPS的機(jī)采血小板45ml。 3.結(jié)果檢測：分別于3h、6h、24h以無菌方式在血小板中取出10ml，其中1ml用于血小板凋亡、活化檢測，2ml用于細(xì)胞因子檢測，其余用于血小板聚集率及低滲性休克檢測。使用流式細(xì)胞儀檢測CD62P及血小板凋亡；血小板低滲休克反應(yīng)采用分光光度法檢測；血小板聚集率使用血小板聚集儀檢測；CD40L、5-HT、TGF-β1、RANTES、IL-1β、TNF-α使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測。 結(jié)果 1. sCD40L檢測結(jié)果在各組加入不同庫存紅細(xì)胞上清孵育后相同檢測時(shí)間點(diǎn)，sCD40L濃度隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而增加（P＜0.05）；在相同庫存紅細(xì)胞上清中，sCD40L濃度隨血小板保存時(shí)間延長而增加（P＜0.05）；在同等條件下，sCD40L濃度隨溶液中LPS濃度增加而增加（P＜0.05）。 2.5-HT檢測結(jié)果在各組加入不同庫存紅細(xì)胞上清孵育后相同檢測時(shí)間點(diǎn)，5-HT濃度隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而增加（P＜0.05）；在相同庫存紅細(xì)胞上清中，5-HT濃度隨血小板保存時(shí)間延長而增加（P＜0.05）；在同等條件下，5-HT濃度隨溶液中LPS濃度增加而增加（P＜0.05）。 3. TGF-β1檢測結(jié)果在各組加入不同庫存紅細(xì)胞上清孵育后相同檢測時(shí)間點(diǎn)，TGF-β1濃度隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而增加（P＜0.05），在相同庫存紅細(xì)胞上清中，TGF-β1的釋放在3h、6h處沒有差別（P＞0.05），在7d紅細(xì)胞上清的刺激下TGF-β1的釋放并沒有隨時(shí)間的延長而增加（P＞0.05）），但在21d、35d紅細(xì)胞上清刺激下，TGF-β1在24h處釋放明顯增加（P＜0.05）；在同等條件下，TGF-β1濃度隨溶液中LPS濃度增加而增加（P＜0.05）。 4. RANTES檢測結(jié)果在各組加入不同庫存紅細(xì)胞上清孵育后相同檢測時(shí)間點(diǎn)，RANTES濃度隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而增加（P＜0.05），在相同庫存紅細(xì)胞上清中，RANTES的釋放在6h、24h處沒有差別（P＞0.05），但與3h相比差異明顯（P＜0.05）。在同等條件下，RANTES濃度隨溶液中LPS濃度增加而增加（P＜0.05）。 5. IL-1β檢測結(jié)果在7d上清刺激下，IL-1β的釋放隨保存時(shí)間延長而增加（P＜0.05）；在21d、35d上清刺激下，3h、6h處IL-1β的釋放并未隨時(shí)間延長而增加（P＞0.05），但在24h處IL-1β的釋放隨時(shí)間延長而增加（P＜0.05）。在各組加入不同庫存紅細(xì)胞上清孵育后相同檢測時(shí)間點(diǎn)，IL-1β的釋放隨保存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而增加（P＜0.05）。在同等條件下，IL-1β的濃度隨溶液中LPS濃度增加而增加（P＜0.05）。 6. CD62檢測結(jié)果在7d上清刺激下，CD62P的表達(dá)在6h、24h處并未隨時(shí)間延長而增加（P＞0.05）；在21d、35d上清刺激下，CD62P的表達(dá)隨時(shí)間延長而增加（P＜0.05）。在同等條件下，CD62P的表達(dá)隨溶液中LPS濃度增加而增加（P＜0.05）。 7.血小板聚集率檢測在各組加入不同庫存紅細(xì)胞上清孵育后相同檢測時(shí)間點(diǎn)，血小板聚集率隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而降低（P＜0.05），在相同庫存紅細(xì)胞上清中，血小板聚集率隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而降低（P＜0.05）；在同等條件下，血小板聚集率隨溶液中LPS濃度增加而降低（P＜0.05）。 8.血小板低滲性休克檢測結(jié)果在各組加入不同庫存紅細(xì)胞上清孵育后相同檢測時(shí)間點(diǎn)，血小板低滲性休克率隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而降低（P＜0.05）；在相同庫存紅細(xì)胞上清中，血小板低滲性休克率隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而降低，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在同等條件下，，血小板低滲性休克率隨溶液中LPS濃度增加而降低（P＜0.05）。 9.AnnexinV檢測結(jié)果在各時(shí)間點(diǎn)及各紅細(xì)胞上清刺激下統(tǒng)計(jì)結(jié)果均無明顯差異（P＞0.05）。 10. TNF-α檢測結(jié)果所有樣本中均未檢測到TNF-α。 結(jié)論 1.懸浮紅細(xì)胞保存時(shí)間越長，其上清刺激血小板產(chǎn)生致炎因子的能力越強(qiáng)。 2.懸浮紅細(xì)胞保存時(shí)間越長，其上清對(duì)血小板的聚集功能影響越大。 3.溶液中LPS濃度越大，血小板越容易活化和產(chǎn)生致炎因子。
[Abstract]:Background

Blood transfusion , transfusion - related immunomodulation ( TRIM ) is a syndrome characterized by immune suppression , which leads to changes of immune system . The concentration of these bioactive substances can be increased with the prolongation of preservation time , which may cause the immune status of recipients to change , which can lead to the effects of TRIM .

It is known that various stimulation signals must be combined with receptors on their corresponding target cell membranes to play a biological role through their specific signaling pathways . In recent studies , platelets are very easy to activate and release a large number of cytokines and growth factors , such as soluble CD40 ligand ( sCD40L ) , tumor necrosis factor alpha ( TNF - 偽 ) , interleukin - 1尾 ( IL - 1尾 ) , transforming growth factor - beta ( TGF - 尾 ) ,

method

1 . Inventory red blood cell supernatant preparation :

Fresh collection of suspended red blood cells was collected and mixed with sterile air bag , and then placed in a 4 鈩

本文編號(hào)：1704232