本文選題：福氏志賀菌新亞型　切入點(diǎn)：表型　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2011年碩士論文

【摘要】：志賀菌屬根據(jù)O抗原不同,分為4群40余血清型:A群痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae);B群福氏志賀菌(Shigella flexneri);C群鮑氏志賀菌(Shigella boydii);D群宋內(nèi)志賀菌(Shigella sonnei)在我國(guó)以B群福氏志賀菌流行為主,在某些地區(qū)福氏志賀菌感染可高達(dá)90%,而福氏志賀菌中以F2a F1a感染為主[1,2]世界各地相繼報(bào)道一些志賀菌新的血清亞型F4c F1c F4x等[3,4,5],我國(guó)于2009年也鑒定出了一種新的亞型SFxv[6] 本研究也從臨床標(biāo)本中鑒定出兩種福氏志賀菌血清學(xué)非典型菌株共62株,他們的血清型與之前文獻(xiàn)報(bào)道有所差異,暫命名為F4cv和F4s,針對(duì)這些菌株做進(jìn)一步研究,包括新亞型的毒力基因多重耐藥性遺傳特點(diǎn)基因差異等特點(diǎn)進(jìn)行分析具體研究?jī)?nèi)容包括以下幾部分: 首先對(duì)監(jiān)測(cè)中分離到的血清學(xué)非典型菌株進(jìn)行血清生化鑒定采用日本生研(Denka Seiken)血清和瑞典福氏志賀菌單克隆抗體血清(Monoclonal Antibodies for Shigella flexneri, MASF)進(jìn)行血清學(xué)鑒定,結(jié)果為:生研血清反應(yīng)式為F4cv: IV+, 7(8)+ F4s: IV+;MASF血清鑒定反應(yīng)式為F4cv: B+, IV:I +, 7(8)+ F4s: B+, IV:I +與之前文獻(xiàn)報(bào)道中的血清型反應(yīng)均有差異,所以暫命名為F4cv和F4s 采用法國(guó)梅里埃API 20E生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn),結(jié)果為F4cv和F4s均分解葡萄糖甘露醇蜜二糖阿拉伯糖,鑒定為志賀菌屬Fxv除了分解葡萄糖發(fā)酵甘露醇蜜二糖阿拉伯糖之外,它的吲哚試驗(yàn)為陽(yáng)性利用Kirby-Bauer瓊脂法,選用14種抗生素藥敏紙片,進(jìn)行抗生素敏感試驗(yàn)結(jié)果為F4cv對(duì)萘啶酸的耐藥率為100%,四環(huán)素耐藥率為96.72%,氨芐西林耐藥率為93.44%,氯霉素阿莫西林-克拉維酸和氨芐西林-舒巴坦耐藥率均為91.80%,磺胺甲VA唑-甲氧芐啶耐藥率為86.89%其中氨芐西林磺胺甲VA唑-甲氧芐啶為我國(guó)臨床痢疾治療常用的一線藥物而且對(duì)目前臨床治療首選的第三代喹諾酮類抗生素諾氟沙星的耐藥性高達(dá)68.85%,高于國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥性為19.67%,對(duì)第四代喹諾酮類抗生素左氧氟沙星耐藥性為18.03%對(duì)第三代頭孢菌素頭孢他啶和頭孢噻肟也出現(xiàn)耐藥株值得引起關(guān)注的是有3株F4cv同時(shí)對(duì)諾氟沙星和第三代頭孢菌素耐藥F4s耐藥譜與F4cv相似Fxv對(duì)諾氟沙星環(huán)丙沙星磺胺甲VA唑-甲氧芐啶敏感性較高而F4cv對(duì)這三種抗生素的敏感性相對(duì)較低,其中F4cv對(duì)諾氟沙星的耐藥率為68.85%通過分析以上結(jié)果,發(fā)現(xiàn)所有F4cv屬于多重耐藥菌株,且對(duì)臨床治療首選藥物耐藥性增強(qiáng),其耐藥譜更加廣泛,且多重耐藥情況復(fù)雜,給臨床治療和疾病防控增加困難 用PCR方法對(duì)這些菌株進(jìn)行毒力基因ipaH ial sen set1A set1B virF檢測(cè)結(jié)果顯示F4s缺失ial毒力基因61株F4cv全部攜帶set1A set1B和ipaH基因,sen ial virF基因攜帶率分別是83.61% 83.61% 75.41% F4cv毒力基因的攜帶模式可以分為6種其中有37株6個(gè)毒力基因全部攜帶,占所有菌株一半以上(60.66%),為優(yōu)勢(shì)毒力基因型說明這些菌株可能具有較強(qiáng)毒力,可能成為細(xì)菌性痢疾流行的優(yōu)勢(shì)菌株,是痢疾的暴發(fā)潛在危險(xiǎn)因素 采用試劑盒提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA,并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果,可以得到質(zhì)粒圖譜61株F4cv菌株分為多個(gè)質(zhì)粒圖譜型,其中33株(54.10%)含有20kb的質(zhì)粒,57株(93.44%)含有10.5kb的質(zhì)粒32株(52.46%)含有8.7kb的質(zhì)粒,56(91.80%)株含有4.8 kb的質(zhì)粒,59株(96.72%)含有3.9kb的質(zhì)粒, 54株(88.52%)含有3.5kb的質(zhì)粒,60株(98.36%)含有2.2kb和1.8kb的質(zhì)粒F4s菌株含有的質(zhì)粒大小為10.5kb 4.8 kb 3.9kb 2.2kb和1.8kb,缺失20kb 8.7kb 3.5kb的質(zhì)粒,這種圖譜型與兩株F4cv菌株相同F(xiàn)xv缺失大小為8.7kb 3.5kb的質(zhì)粒采用BioNumerics軟件進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:F4s單獨(dú)一型,并且與兩株F4cv菌株帶型相同,說明他們攜帶的質(zhì)粒相同,親緣關(guān)系密切相似度為90%時(shí),F4cv與Fxv屬于同一聚類F4s F4cv Fxv Fx血清型菌株的質(zhì)粒圖譜均有差異但是聚類分析表明他們相互之間親緣關(guān)系較近 采用國(guó)際食源性監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)PulseNet推薦的PFGE標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)其進(jìn)行基因分型分析通過對(duì)XbaI和NotI兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行PFGE,最終選擇NotI限制性內(nèi)切酶對(duì)菌株進(jìn)行酶切電泳通過分析電泳圖譜,F4s F4cv Fxv之間相差1-3個(gè)條帶,說明三者之間親緣關(guān)系較密切BioNumerics軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行聚類分析聚類相似性為92%時(shí),可將三種志賀菌分為27個(gè)帶型,7個(gè)聚類群,分別為A-G聚類可以將其中61株F4cv菌株分為25個(gè)帶型,7個(gè)聚類,表現(xiàn)出遺傳多樣性F4s為一單獨(dú)帶型在相似性容許度為96%時(shí),F4s與F4cv屬于B聚類群的同一個(gè)亞類,說明他們的親緣關(guān)系比較接近,F4s可能由F4cv進(jìn)化形成此時(shí),Fxv與F4cv屬于A聚類群的一個(gè)亞類,F4cv可能由Fxv演化而來根據(jù)EcMLST網(wǎng)站(http://www.shigatox.net/mlst)數(shù)據(jù)庫(kù)提供的15個(gè)管家基因位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)各管家基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行堿基序列測(cè)定,與EcMLST數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行對(duì)比,得到各菌株相應(yīng)的序列型(sequence type, ST) 61株F4cv及F4s均屬于一個(gè)新的序列型ST100與數(shù)據(jù)庫(kù)中其他序列型比較發(fā)現(xiàn)與ST18ST86只有一個(gè)位點(diǎn)差異,親緣關(guān)系較近BioNumerics軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生圖可見,ST100所在的克隆群10是從出血性大腸桿菌所在的克隆群14分支進(jìn)化而來MLST和PFGE分析結(jié)果顯示MLST的分型能力要明顯低于PFGE,PFGE在對(duì)同一血清型菌株的分辨力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于MLST 通過PCR技術(shù),對(duì)文獻(xiàn)中提供的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)位點(diǎn)進(jìn)行篩選,得到多態(tài)性較好的5個(gè)VNTR位點(diǎn)SF3 SF6 SF11 SF12 SF34結(jié)合PCR產(chǎn)物測(cè)序電泳圖譜,利用BioNumerics軟件,對(duì)其多態(tài)性進(jìn)行分析MLVA可將67株福氏志賀菌分為45個(gè)型,其中61株F4cv可分為43個(gè)型F4s單獨(dú)一型,Fxv單獨(dú)一型最小生成樹顯示F4s與Fxv分別位于兩個(gè)群的不同分支上,但都是由F4cv分支而來,說明他們?cè)诨蛐蜕吓cF4cv存在差別,但是又有遠(yuǎn)近不等的遺傳進(jìn)化關(guān)系F4cv各個(gè)菌株之間親緣關(guān)系也呈現(xiàn)遠(yuǎn)近不等,說明他們之間也存在不同程度的變異 通過以上分析,血清型將F4cv和F4s鑒定為新的血清亞型,兩者具有相同的生化特點(diǎn)和相似的耐藥情況與Fxv比較,F4cv耐藥性增強(qiáng),且出現(xiàn)強(qiáng)耐藥菌株經(jīng)PFGE MLST MLVA等方法進(jìn)行基因型分析,可以認(rèn)為F4s F4cvFxv之間親緣關(guān)系較密切,F4s F4cv有可能都是從Fxv進(jìn)化而來福氏志賀菌新亞型的出現(xiàn)容易引起流行暴發(fā),以及對(duì)臨床一線抗生素耐藥性增強(qiáng),這些問題給細(xì)菌性痢疾的防控帶來挑戰(zhàn)本研究針對(duì)這些問題所做的表型和基因型的分析,為解決治療和防控問題提供了理論依據(jù)
[Abstract]:Shigella strains were divided into 4 groups of 40 serotypes according to the O antigens : A group of Shigella strains , group B , Shigella flexus , Shigella boydii and Shigella boydii .

In this study , 62 strains of Shigella strains were identified from clinical specimens , and their serotypes were different from those reported in the previous literature . These strains were named F4cv and F4s , and further studies were carried out for these strains .

The serum biochemical identification of serum non - typical strains isolated from monitoring was carried out by using the serum of Denka Seiken serum and monoclonal antibody against Shigella flexus ( MASF ) , and the results were as follows : the serum reaction formula was F4cv : IV + , 7 ( 8 ) + F4s : IV + ; the serum identification reaction formula was F4cv : B + , IV : I + , 7 ( 8 ) + F4s : B + , IV : I + .

The drug resistance of F4cv to Norfloxacin was 68.85 % . The drug resistance rate of F4cv was 96.72 % . The drug resistance rate was 93.44 % .

The results showed that the F4cv genes of F4cv were all carrying set1A set1B and ipaH genes , and the carrying pattern of senial virF gene was 83.61 % 83.61 % 75.41 % F4cv . The carrying pattern of virulence genes could be divided into 6 types , which accounted for more than half of all strains ( 60.66 % ) .

The results showed that the strain F4cv of the strain F4cv consists of a plasmid with a size of 8 . 7kb , a plasmid of 56 ( 91.80 % ) containing a plasmid of 3.9kb , a plasmid of 56 ( 91.80 % ) containing a plasmid of 3.9kb , and a plasmid with the same Fxv deletion size of 8.7kb .

The results showed that F4cv and F4cv belong to one subclass of cluster A . Fxv and F4cv belong to one subclass of cluster A . Fxv and F4cv belong to one subclass of cluster A .

By means of PCR technique , the variable number tandem repeat sequence ( VNTR ) sites provided in the literature were screened to obtain five VNTR loci SF3 SF6 SF11 SF12 SF34 with better polymorphism .

Through the above analysis , the serotypes F4cv and F4s are identified as new serum subtypes . Both of them have the same biochemical characteristics and similar resistance to Fxv .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1703143