本文選題：缺氧缺血腦損傷　切入點：維生素A　出處：《重慶醫(yī)科大學》2011年博士論文

【摘要】：目的探討體內維生素A(vitamin A, VA)水平對缺氧缺血腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)大鼠神經(jīng)修復的影響。方法將84只7d齡wistar大鼠隨機分為VA正常( VA normal, VAN),VA缺乏( VA deficiency, VAD)和假手術對照(control)組。按照本課題組常規(guī)方法建立VA正常和缺乏新生大鼠模型,按照經(jīng)典Rice法HIBD造模。高效液相色譜法(HPLC)檢測血清VA水平評估模型鼠體內VA營養(yǎng)水平。在修復中晚期測試神經(jīng)功能損傷評分(mNSS),Morris水迷宮和穿梭箱評估神經(jīng)認知功能,鈣影像檢測海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元的NMDA誘導鈣內流現(xiàn)象。在極期EdU新生細胞標記術評估VAD和VAN兩組損傷后細胞新生的能力,Tunel染色評估腦組織細胞凋亡程度,Nissl染色評估VAD和VAN兩組海馬組織萎縮程度。流式細胞術分析缺氧缺糖損傷(OGD)的原代海馬神經(jīng)元的細胞凋亡和線粒體膜電位變化。進一步分析各組海馬組織和原代海馬神經(jīng)元RA信號,TGF-β信號和線粒體凋亡通路分子的基因和蛋白水平差異。 結果(1)整個實驗期VAD、VAN和Control三組模型鼠血清VA水平分別控制在0.4~0.7μmol/L、0.7~1.1μmol/L、0.65~1.05μmol/L,符合實驗要求。 (2)功能學結果:術后7、14、21和28d神經(jīng)功能損傷評分VAD組顯著高于VAN組(P0.05),control組評分顯著低于其它兩組(P0.01)。Morris水迷宮測試VAD組平均潛伏時間在測試的2~5d顯著長于VAN組(P0.05),穿越平臺次數(shù)顯著低于VAN組(P0.05),Control組平臺平均潛伏時間在整個測試期均顯著低于其它兩組(P0.05),穿越平臺次數(shù)顯著高于其它兩組(P0.01)。穿梭箱測試VAD組在測試2~5d天主動逃避率顯著低于VAN組(P0.05),未逃避率顯著高于VAN組(P0.05)。Control組主動逃避率顯著高于其它兩組(P0.05),未逃避率顯著低于其它兩組(P0.05)。VAD組海馬CA1區(qū)椎體細胞的50μmol/LNMDA激發(fā)的鈣震蕩效應在HIBD損傷的急性期(術后3~14d)明顯強于VAN組(P0.05),而在修復的晚期(術后14~30d)則顯著弱于VAN組(P0.01)。提示體內VA水平正常可顯著促進HIBD后神經(jīng)功能恢復。 (3)組織學結果:術后3d,大體形態(tài)可見VAD組的HIBD損傷側(左側半腦)明顯萎縮重于VAN組,VAD組海馬CA3部與皮層的間隙顯著寬于VAN組,且海馬體小于VAN組,在術后7d兩組無明顯差異。術后2d~7d,VAD組海馬CA1、CA3、DG和頂葉皮層,顳葉皮層的EdU陽性細胞(紅色熒光)顯著少于VAN組,且海馬的新生細胞主要出現(xiàn)在椎體細胞層,皮層主要區(qū)域在layer2~5區(qū),且術后2d細胞新生明顯多于7d。HIBD損傷后3dVAD組海馬CA1、CA3、DG和頂葉皮層,顳葉皮層的細胞凋亡明顯重于VAN組(黃箭頭所示綠色熒光)。且兩組的海馬細胞凋亡主要存在于椎體細胞層,皮層凋亡主要出現(xiàn)在layer4~5。在損傷后7d凋亡也顯著重于VAN組,而且凋亡的發(fā)生區(qū)也開始擴散,海馬細胞凋亡在椎體層區(qū)和分子層區(qū),皮層的layer2~5都可見明顯的細胞凋亡。 (4)基因蛋白結果:我們發(fā)現(xiàn)RARα的mRNA在HIBD損傷的極期到中期(術后3~14d)VAD組都顯著高于VAN組(P0.05),在修復中到晚期(術后14~28d)RARα的mRNA VAD組則顯著低于VAN組(P0.05),RARα是各RA受體表達的優(yōu)勢受體。進一步發(fā)現(xiàn)VAD組的神經(jīng)元標志物NSE的mRNA在術后3d、14d都顯著低于VAN組(P0.01),神經(jīng)膠質細胞標志物GFAP的mRNA在術后1、7、14d VAD組則顯著低于VAN組(P0.05),神經(jīng)干細胞標志物Nestin的mRNA水平在術后3、7、14dVAD組顯著低于VAN組(P0.05),在術后7dVAD組GDNF表達顯著低于VAN組(P0.05),而TGF-β1、2在損傷后1~3dVAD組顯著高于VAN組(P0.01),7dVAD組顯著低于VAN組(P0.01)。于是我們檢測HIBD的極期和中期細胞凋亡的信號通路在VAD和VAN兩組間的差異,在術后1、7dVAD組的凋亡蛋白caspase-3mRNA水平顯著高于VAN組,caspase-8在術后1、3、7d顯著高于VAN組(P0.05),線粒體凋亡通路的bax表達在術后1、3、7d顯著高于VAN組(P0.05),bak在術后1d顯著高于VAN組(P0.01),bid在7、14d顯著高于VAN組(P0.01),而線粒體凋亡通路中的抗凋亡分子bcl-2在術后7、14d顯著低于VAN組(P0.05)。以上內容提示體內VA正常促進HIBD神經(jīng)組織功能修復的可能機制是因為RA信號作用于TGF-β信號進而影響線粒體凋亡級聯(lián)信號通路而作用于神經(jīng)細胞凋亡。 (5) RA信號對OGD損傷海馬神經(jīng)元凋亡的影響:1~5μmol/LATRA處理的神經(jīng)元OGD損傷后細胞凋亡率較其它濃度ATRA處理組明顯更低(P0.01)。進一步我們通過過表達RARα,沉默RARα來探討是否RARα介導適宜RA信號抑制細胞凋亡,發(fā)現(xiàn)1μmol/LATRA處理的神經(jīng)元OGD損傷后細胞凋亡率最低(P0.01),而過表達RARα+1μmol/L ATRA組,沉默RARα+1μmol/L ATRA組凋亡率最高(P0.05)。1μmol/LATRA處理的神經(jīng)元OGD損傷后線粒體膜電位異常率最低(P0.05),而且沉默+1μmol/L ATRA顯著低于沉默組(P0.05),過表達+1μmol/L ATRA組顯著高于過表達組(P0.01),這種類似于一種回歸效應。提示RA信號可能主要作用于線粒體凋亡通路,且存在一個適宜的RA信號在抑制線粒體凋亡。 (6)可能機制:我們用不同濃度ATRA處理OGD損傷的原代海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)RARα的mRNA水平與ATRA濃度存在劑量相關性,ATRA濃度越高則RARα的mRNA水平越高。進一步發(fā)現(xiàn)過表達RARα+1μmol/L ATRA組和沉默RARα+1μmol/L ATRA組線粒體凋亡通路的caspase-3、caspase-8、Bid、bax和bak的mRNA水平或蛋白水平顯著高于1μmol/LATRA處理組和OGD對照組(P0.01),而bax的mRNA水平在1μmol/LATRA處理組顯著低于OGD對照組(P0.01),抗凋亡分子bcl-2則顯著高于OGD對照組(P0.01),過表達RARα+1μmol/L ATRA組bcl-2水平顯著高于沉默組和OGD對照組(P0.01)。這都提示RA信號的抗凋亡作用通過線粒體凋亡通路實現(xiàn)。過表達和沉默組的TGF-β表達都顯著低于1μmol/L ATRA處理組(P0.01),而OGD組TGF-β表達最高(P0.01),1μmol/L ATRA處理組處于中間水平。1μmol/L ATRA處理組的GDNF表達顯著高于沉默組和OGD組(P0.01),且過表達組最高(P0.01),但同時過表達組的凋亡信號分子表達也最高,以上結果提示RA信號抗凋亡可能是通過RARα影響GDNF,TGF-β信號從而影響線粒體凋亡通路,而同時RA信號還通過其他通路影響著凋亡。 結論HIBD損傷的機體處于適宜VA營養(yǎng)水平時可顯著促進神經(jīng)功能的修復。可能的病理生理機制是適宜VA水平促進極期的皮層神經(jīng)細胞新生和抑制細胞凋亡,分子機制是適宜RA信號促進適宜TGF-β信號和GDNF進而抑制bax表達上調bcl-2表達,從而抑制線粒體凋亡通路,最終抑制缺血缺氧損傷所致的細胞凋亡。這提示體內維持正常的VA水平對HIBD修復有著良好的促進作用。 目的探討體內維生素A(vitamin A, VA)水平對大鼠骨髓間充質干細胞(rat mesenchymal stem cell, rMSCs)移植治療缺氧缺血腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)大鼠神經(jīng)修復的影響。方法將144只7d齡wistar大鼠隨機分為VA正常移植細胞組(VANM),VA缺乏移植細胞組(VADM)和HIBD對照組;按照本課題組常規(guī)方法建立VA正常和缺乏新生大鼠模型,按照經(jīng)典Rice法HIBD造模,損傷24h后每只大鼠腹腔移植1*106rMSCs,高效液相色譜法檢測血清VA水平,在修復中晚期測試神經(jīng)功能損傷評分(mNSS)、Morris水迷宮和穿梭箱評估神經(jīng)認知功能,鈣影像分析海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元的NMDA誘導的鈣內流現(xiàn)象;TTC染色評估損傷后腦組織梗死面積,在極期用EdU新生細胞標記術評估細胞新生的能力,通過Tunel染色評估細胞凋亡;流式細胞術檢測缺氧缺糖損傷(OGD)的原代海馬神經(jīng)元細胞凋亡和線粒體膜電位變化;進一步分析海馬組織和原代海馬神經(jīng)元RA信號,TGF-β信號和線粒體凋亡通路分子的基因和蛋白水平。 結果 (1)整個實驗期VADM、VANM和HIBD三組模型鼠血清VA水平分別控制在0.4~0.8μmol/L、0.7~1.3μmol/L、0.6~1.1μmol/L,符合實驗要求。 (2)功能學結果:術后7、14、21和28d神經(jīng)功能損傷評分VADM組顯著高于VANM組(P0.05),HIBD組評分顯著高于其它兩組(P0.05)。術后23d開始的Morris水迷宮測試VADM組的尋找平臺平均潛伏時間和尋找平臺距離在測試的2~5d顯著長于VANM組(P0.05),穿越平臺次數(shù)顯著低于VANM組(P0.01),HIBD組的尋找平臺平均潛伏時間和尋找平臺距離在整個測試期均顯著長于其它兩組(P0.05),穿越平臺次數(shù)顯著少于其它兩組(P0.01)。術后28d開始的穿梭箱測試VADM組在測試期2~5d主動逃避率顯著低于VANM組(P0.05),在4~5d未逃避率顯著高于VANM組(P0.05),HIBD組主動逃避率顯著低于其它兩組(P0.05),未逃避率顯著高于其它兩組(P0.05)。VADM組海馬CA1區(qū)椎體細胞的50μmol/LNMDA激發(fā)的鈣震蕩效應在HIBD損傷的急性期(術后3~7d)明顯強于VANM組(P0.05),而在修復的晚期(術后14~30d)則顯著弱于VANM組(P0.01)。以上內容提示體內VA正常可顯著促進rMSCs移植治療HIBD后的神經(jīng)功能恢復。 (3)組織學結果:術后7d大體形態(tài)可見VADM組的損傷側(左側半腦)梗死面積顯著大于VANM組(P0.05),但VADM和VANM梗死面積均顯著小于HIBD組(P0.05)。rMSCs移植后2、7d我們評估rMSCs在腦內定植,在移植rMSCs兩組僅在皮層區(qū)發(fā)現(xiàn)有rMSCs的定植(綠色熒光),而在海馬區(qū)未發(fā)現(xiàn)有rMSCs的定植,并且在顳葉和頂葉皮層,移植后2d和7dVANM組rMSCs定植要顯著多于VADM組(P0.05)。移植后2d、7d,VADM組海馬CA1、CA3、DG和頂葉皮層,顳葉皮層的新生細胞(EdU陽性細胞,紅色熒光)顯著少于VANM組,且海馬的新生細胞主要出現(xiàn)在椎體細胞層,皮層主要區(qū)域在layer2~5區(qū),移植后2dEdU陽性細胞顯著多于7d。rMSCs移植后2dVADM組海馬CA1、CA3、DG和頂葉皮層,顳葉皮層的細胞凋亡明顯重于VANM組(黃箭頭所示綠色熒光,且兩組的海馬細胞凋亡主要存在于椎體細胞層和分子層區(qū),皮層凋亡主要出現(xiàn)在layer3~5,在移植后7dVADM凋亡也顯著重于VANM組,且凋亡的發(fā)生區(qū)較2d開始縮小,海馬細胞凋亡集中于椎體層區(qū),皮層的layer2~5都可見明顯的細胞凋亡。以上內容提示體內VA缺乏可顯著抑制rMSCs移植治療HIBD后的神經(jīng)組織修復。 (4)基因和蛋白表達結果:發(fā)現(xiàn)RARα的mRNA和蛋白水平在HIBD損傷的極期(術后3~7d)VADM組都顯著高于VANM組(P0.05),在修復中到晚期(術后14~28d)RARα的mRNA和蛋白水平VADM組則顯著低于VANM組(P0.01),RARα和RXRγ受體是各RA受體表達的優(yōu)勢受體。進一步發(fā)現(xiàn)VADM組的神經(jīng)元標志物NSE的mRNA和蛋白水平在HIBD術后14d都顯著低于VANM組(P0.05),神經(jīng)膠質細胞標志物GFAP的mRNA和蛋白水平在21~30d VADM組則顯著低于VANM組(P0.01),神經(jīng)干細胞標志物Nestin的mRNA和蛋白水平在HIBD術后3、14dVADM組顯著低于VANM組(P0.01),在損傷后3、7、14dVADM組GDNF表達顯著低于VANM組(P0.05),而TGF-β1在損傷后3~7dVADM組顯著高于VANM組(P0.01),7~14dVADM組顯著低于VANM組(P0.01)。進一步檢測HIBD的極期和中期細胞凋亡的信號通路在VADM和VANM兩組間的差異,在術后7dVADM組的凋亡蛋白caspase-3、bid、bax和bak的mRNA或蛋白水平顯著高于VANM組(P0.05), caspase-8的mRNA和蛋白水平在術后3、7、14d顯著高于VANM組(P0.05),而線粒體凋亡通路中的抗凋亡分子bcl-2的mRNA和蛋白水平在術后7、14d顯著低于VANM組(P0.05)。以上內容提示體內VA正常促進rMSCs移植治療HIBD神經(jīng)組織功能修復的可能機制是因為RA信號作用于TGF-β信號進而影響線粒體凋亡級聯(lián)信號通路作用于神經(jīng)細胞凋亡。 (5) ATRA聯(lián)合rMSCs培養(yǎng)對OGD損傷原代海馬神經(jīng)元凋亡影響:rMSCs處理各組凋亡率顯著低于OGD組,rMSCs+1μmol/LATRA處理的神經(jīng)元OGD損傷后細胞凋亡率較其它處理組明顯更低(P0.05)。rMSCs+1μmol/LATRA處理的神經(jīng)元OGD損傷后線粒體膜電位異常率較其它處理組更低(P0.05),而高濃度ATRA處理組線粒體膜電位異常率與OGD組無差異。以上結果提示適度RA刺激可顯著促進rMSCs的抗凋亡作用,而高濃度可能抵消此效應。 (6)可能機制:發(fā)現(xiàn)RARα的mRNA和蛋白水平與ATRA濃度存在劑量相關遞增性,ATRA濃度越高則RARα的mRNA和蛋白水平越高,rMSCs聯(lián)合1μmol/LATRA處理組RARα表達處于中間水平,而且對照組的RARα表達最低(P0.01)。神經(jīng)元標志蛋白NSE的表達對照組最高(P0.01),rMSCs處理各組NSE表達顯著高于OGD組(P0.05),其中rMSCs聯(lián)合1μmol/LATRA處理組NSE表達較其他損傷組表達最高(P0.01),OGD組NSE表達則最低(P0.05)。rMSCs處理各組的GDNF基因和蛋白表達顯著高于OGD組(P0.01),其中rMSCs聯(lián)合1μmol/LATRA處理組GDNF表達較其他組表達最高(P0.01)。TGF-β1、2的表達rMSCs處理后較對照組升高,但低于OGD組,rMSCs聯(lián)合1μmol/LATRA處理組TGF-β1、2的表達則處于中間水平(P0.05)。我們深入檢測細胞線粒體凋亡信號通路的關鍵分子表達水平變化, rMSCs處理各組能顯著降低凋亡信號分子caspase-3、caspase-8、bid、bax、bak的表達(P0.01),而且rMSCs聯(lián)合1μmol/LATRA處理組表達更低(P0.05),而高濃度和無ATRA處理組表達則相對高于rMSCs聯(lián)合1μmol/LATRA處理組;而rMSCs處理各組的抗凋亡分子bcl-2的表達顯著高于OGD組,其中rMSCs聯(lián)合1μmol/LATRA處理組表達最高(P0.01),而高濃度和無ATRA處理組表達則相對低于rMSCs聯(lián)合1μmol/LATRA處理組。以上內容提示OGD損傷的神經(jīng)元,rMSCs處理可顯著抗凋亡,聯(lián)合不同濃度ATRA刺激,發(fā)現(xiàn)在較低濃度時可促進rMSCs抗凋亡,高濃度或無RA刺激則抑制rMSCs抗凋亡。提示有著一個最適的RA信號豐度聯(lián)合rMSCs發(fā)揮最強的抗凋亡作用,可能的機制是通過適宜的RA信號豐度影響GDNF,TGF-β信號進而直接影響線粒體凋亡,另外適宜的RA信號也導致TGF-β信號維持在一適宜的水平進而通過促進rMSCs旁分泌效應影響線粒體凋亡信號通路。 結論機體處于適宜VA營養(yǎng)水平時可顯著促進rMSCs移植治療HIBD,可能的病理機制是適宜VA水平本身促進極期的神經(jīng)細胞新生和抑制腦組織梗死萎縮并疊加對rMSCs定植和活性的促進進而影響細胞新生和組織梗死萎縮,其分子機制是適宜RA信號聯(lián)合rMSCs的旁分泌效應與適宜TGF-β信號和GDNF互為影響進而抑制線粒體凋亡通路級聯(lián)表達并上調bcl-2表達從而抑制線粒體凋亡通路最終抑制缺氧缺血腦損傷所致的細胞凋亡。這提示體內維持體外正常的VA水平內環(huán)境對rMSCs移植治療HIBD修復有著良好的促進作用。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：1701153