本文選題：骨髓間充質干細胞　切入點：生長因子　出處：《安徽醫(yī)科大學》2011年碩士論文

【摘要】：目的1.探討體外進行兔骨髓間充質干細胞(BMSC)的分離、培養(yǎng)和鑒定的方法,為下一步組織工程軟骨構建奠定基礎。2.研究兔骨髓間充質干細胞(BMSC)復合同種異體脫鈣骨(DBM)在誘導液刺激下體外培養(yǎng)形成軟骨。 方法1.采用同源雄性新西蘭幼兔(4～6周齡)全骨髓貼壁篩選法培養(yǎng)原代BMSC,傳代至第二代細胞時部分標本行流式細胞表型鑒定,第三代細胞融合至約80%時培養(yǎng)基中加入成軟骨誘導液:含轉化生長因子(Transforming Growth Factor,TGF)-β1 10ng/ml、胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor,IGF)-Ⅰ20ng/ml、維生素C 50ng/ml,取誘導14d后以及誘導前的細胞進行爬片并做Ⅱ型膠原免疫組化。2.根據Urist提供的方法制作DBM,用電鏡觀察DBM內部結構。3.將誘導后的BMSC種植于DBM支架進行體外培養(yǎng),于4、8、12周分別取材,行大體形態(tài)觀察并制石蠟切片行蘇木素伊紅染色(Hematoxylin-Eosin Staining,HE)、甲苯胺藍(Toluidine Blue,TB)染色、Masson染色、Ⅱ型膠原免疫組化等組織學觀察。 結果1.本實驗方法分離和培養(yǎng)的MSCs形態(tài)特征明顯,均呈梭形,原代培養(yǎng)10～14天細胞融合約90%,增殖傳代的細胞6～7天可達90%融合。所培養(yǎng)的細胞經流式細胞儀鑒定,CD44(+),CD34(-)。MSCs經定向誘導后表現(xiàn)出軟骨細胞的特性。2.制備得到的DBM為三維立體疏松多孔的海綿樣結構,電鏡顯示DBM內部的孔隙結構并相互交通。3.誘導后的BMSCs與DBM復合培養(yǎng)12w后,取出行組織學切片觀察及Ⅱ型膠原免疫組化觀測:HE染色見軟骨細胞增生,胞核染色呈藍色;甲苯胺藍染色見軟骨細胞排列無序,周圍基質包繞;Masson染色見陽性,見軟骨細胞排列無序;Ⅱ型膠原免疫組織化學反應見細胞胞漿和外基質中出現(xiàn)棕黃色顆粒,Ⅱ型膠原染色陽性。 結論1.應用貼壁細胞篩選法可獲得純度較高的骨髓間充質干細胞,體外給予TGF-β1和IGF-Ⅰ可促進MSCs增殖和成軟骨分化;2.MSCs與同種異體DBM結合后可在體外成功培養(yǎng)出組織工程軟骨;3.作為“同種異體骨復合外周血干細胞關節(jié)腔內培養(yǎng)工程軟骨”的系列研究的一部分,本實驗為過渡到下一階段“體內成軟骨研究”奠定了良好基礎,并為后續(xù)研究提供了良好的支撐和對照。
[Abstract]:Objective 1. To investigate the method of isolation, culture and identification of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) in vitro. To lay the foundation for the further construction of tissue engineered cartilage. To study the formation of cartilage in rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) combined with allogeneic decalcified bone marrow (DBM) stimulated by induction fluid in vitro. Methods 1. Primary BMSCs were cultured by the method of bone marrow adherent screening at the age of 4 ~ 6 weeks in the homologous male New Zealand rabbits. The phenotypes of BMSCs were identified by flow cytometry in some samples from passage to the second generation of cells. 2. When the third generation cells were fused to the medium of about 80th generation, the chondrogenic inducer was added to the medium: TGF- 尾 1 10 ng / ml containing transforming Growth factor- 尾 1 10 ng / ml, insulin-like Growth factor- 鈪，

本文編號：1700585