本文選題：樹突膜片鉗記錄　切入點(diǎn)：樹突特性　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：膜片鉗技術(shù)是上個(gè)世紀(jì)90年代初興起的一種記錄細(xì)胞膜離子通道電生理特性的技術(shù),它為了解生物膜離子通道的門控動力學(xué)特征以及通透性等提供了最直接的手段。在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域,膜片鉗技術(shù)多用于探索神經(jīng)元上離子通道的分布特點(diǎn)和功能特性。大多數(shù)的膜片鉗記錄是在胞體上進(jìn)行的。神經(jīng)元的另一重要結(jié)構(gòu)——樹突,因其直徑較小,一直以來限制樹突膜片鉗技術(shù)的操作。然而,樹突接受大多數(shù)投射到神經(jīng)元的突觸傳入,其上分布著大量不同類型的離子通道,是突觸整合、突觸可塑性調(diào)節(jié)的重要位點(diǎn),具有重要的生理功能。因此在樹突上進(jìn)行直接的膜片鉗記錄,將為進(jìn)一步了解樹突的興奮性特點(diǎn)提供新的機(jī)會。 我們在成功進(jìn)行胞體膜片鉗記錄的基礎(chǔ)上對樹突膜片鉗記錄進(jìn)行了摸索。我們的實(shí)驗(yàn)以海馬腦片為標(biāo)本,在微分干涉相襯(Differential interference contrast, DIC)顯微鏡下觀察到健康的CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的樹突后操作的。雖然樹突記錄的基本操作技術(shù)類似于胞體記錄,但與后者相比,樹突記錄需要更高的精確度。經(jīng)過多次嘗試,我們發(fā)現(xiàn),要提高樹突記錄的成功率,需要注意的主要有以下幾個(gè)方面：使用最優(yōu)化的膜片鉗設(shè)備；提高腦片質(zhì)量,以看到更多適合封接的健康樹突；電極尖端直徑的大小要合適,過大過小都會影響樹突的封接；電極接觸樹突的方式要正確,不可過度；破膜時(shí)所用負(fù)壓要適度,也可采用電擊破或強(qiáng)超極化的方式破膜。 我們在CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的胞體和頂樹突同時(shí)記錄,研究樹突的被動特性和主動特性。實(shí)驗(yàn)中,我們分別在頂樹突的不同位點(diǎn),給予相同大小的興奮性突觸后電流(Excitatory postsynaptic current, EPSC)樣注電流,在胞體和頂樹突同時(shí)記錄。結(jié)果發(fā)現(xiàn),樹突注電流位點(diǎn)距離胞體越遠(yuǎn),產(chǎn)生的樹突局部興奮性突觸后電位(Excitatory postsynaptic potential, EPSP)幅度越大,而同時(shí)在胞體記錄的EPSP(?)的幅度則更小,Half-width與Rise time則更長。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明由于樹突本身的特性,同樣大小的注電流在樹突較遠(yuǎn)端產(chǎn)生的EPSPi幅度比在較近端產(chǎn)生的大,而且EPSP在向胞體傳遞的過程中幅度逐漸衰減,持續(xù)時(shí)間逐漸延長。我們換用玻璃電極刺激海馬CA1區(qū)的輻射層(Stratum radiatum, SR),分別在不同的樹突位點(diǎn)和胞體同時(shí)記錄,得到一致的結(jié)果。因此我們得出結(jié)論：EPSP的傳遞效率依賴突觸傳入的位點(diǎn)。 為觀察EPSP由胞體向樹突方向的傳遞情況,我們在胞體給予一定大小的EPSC-樣注電流,分別在樹突不同位點(diǎn)和胞體同時(shí)記錄。結(jié)果發(fā)現(xiàn),EPSP在向樹突傳遞的過程中,幅度逐漸衰減,Half-width與Rise time逐漸增加。 基底樹突直徑非常小,一方面要求封接基底樹突所用的電極尖端直徑更精細(xì),同時(shí)也需要更精確的封接方法,因此大大增加了封接的難度。我們在多次失敗經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上終于在基底樹突記錄到電流。 在獲得高質(zhì)量樹突記錄的基礎(chǔ)上,我們打算對不同樹突來源的兩個(gè)EPSP的整合機(jī)制進(jìn)行探討。我們用玻璃電極與金屬電極同時(shí)刺激海馬CA1區(qū)的SR和始層(Stratum oriens, SO),-10ms的時(shí)間窗(SO刺激在SR刺激之前10ms)以10Hz的頻率,將頂樹突EPSP與基底樹突EPSP配對誘導(dǎo)60次,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EPSP的長時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation, LTP)現(xiàn)象。同樣的protocol下,+10ms時(shí)獲得EPSP的長時(shí)程抑制現(xiàn)象(Long-term depression, LTD)。我們計(jì)劃借助頂樹突與胞體、胞體與基底樹突同時(shí)記錄的方法探索頂樹突EPSP與基底樹突EPSP整合的機(jī)制。
[Abstract]:The technique of patch clamp technique is a technique of recording the electrophysiological properties of ionic channel in the cell membrane . It provides the most direct means for understanding the characteristics of the channel and the permeability of the membrane . In the field of neurosciences , the membrane patch clamp technique is used to explore the distribution characteristics and functional characteristics of ion channels in neurons .

We have carried on the study of dendritic patch clamp recordings on the basis of successful cell patch clamp recording . Our experiments show that dendritic cells of healthy CA1 pyramidal neurons are operated under differential interference contrast ( DIC ) microscope . Although the basic operating techniques of dendritic records are similar to those of the latter , the dendritic records require higher accuracy . After many attempts , we have found that to improve the success rate of dendritic records , it is important to pay attention to the following aspects : the use of optimized patch clamp equipment ;
improve the quality of the brain slices so as to see more healthy dendrites suitable for sealing ;
The diameter of the tip of the electrode is suitable , too much too small to affect the sealing of the dendritic ;
the method of electrode contact dendritic is correct and not excessive ;
the negative pressure used in the membrane breaking is moderate , and the membrane can be broken by adopting a mode of electric shock or strong hyperpolarization .

At the same time , we found that the greater the EPSPi amplitude at the distal end of the dendritic cells , the greater the amplitude of the EPSP at the distal end of the dendritic cells , and longer in the EPSP ( ? ) in the cell body . The results show that the transmission efficiency of EPSP depends on the afferent locus of the synaptic transmission .

In order to observe the transmission of EPSP from the cytoplasm to the dendritic direction , we recorded EPSC - like injection currents with a certain size in the cytoplasm at the same time . The results showed that the amplitude of EPSP gradually decreased , half - width and rise time increased gradually in the process of transferring dendritic cells to dendritic cells .

The diameter of the base dendritic is very small , on the one hand , it is required that the diameter of the electrode tip used for sealing the base dendritic is finer , and more accurate sealing method is needed , thus greatly increasing the difficulty of sealing .

On the basis of obtaining high - quality dendritic records , we intend to explore the integration mechanism of two EPSPs from different dendritic sources . We use the glass electrode and the metal electrode to stimulate the SR and the initial layer ( SO ) in the CA1 region of the hippocampus at the same time . The time window of 10 Hz ( 10 ms before SR stimulation ) is used to pair the top dendritic EPSP and the base dendritic EPSP to induce 60 times . The results show that the long - term depression ( LTP ) phenomenon of EPSP is obtained . Under the same protocol , the long - term depression ( LTD ) of EPSP is obtained at + 10 ms . We plan to explore the mechanism of the integration of the top dendritic EPSP with the base dendritic EPSP by means of simultaneous recording of the top dendritic cell and the cell body , the cell body and the base dendritic cell .

【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R338

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本文編號：1690859