本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：細(xì)胞培養(yǎng)　出處：《山東大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：1、骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、培養(yǎng)與擴(kuò)增 目的：優(yōu)化獲取兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞方法,并對細(xì)胞進(jìn)行純化、鑒定及擴(kuò)增,同時(shí)對其生物學(xué)性狀進(jìn)行研究。 方法：取新生新西蘭大耳白兔骨髓5.0ml,采用密度梯度離心法、貼壁篩選法并結(jié)合傳代對其進(jìn)行純化,觀察細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)志物的表達(dá),從而對其進(jìn)行鑒定。觀察第1、3、5、7代細(xì)胞的增殖情況,并繪制出生長曲線。 結(jié)果：經(jīng)密度梯度離心、貼壁篩選并結(jié)合細(xì)胞傳代均可得到貼壁細(xì)胞集落,密度梯度離心集落形成率稍高,但貼壁篩選法操作更簡便。傳代至第3代和第5代細(xì)胞形態(tài)單一,細(xì)胞排列具有典型的漩渦狀結(jié)構(gòu)。第1、3、5代細(xì)胞增殖能力強(qiáng),生長旺盛；至第7代細(xì)胞增殖明顯減弱。所分離培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CD44、CD90,不表達(dá)CD34。 結(jié)論：分離培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞,且成份單一,具有多向分化潛能,且無造血系干細(xì)胞標(biāo)志。經(jīng)體外傳代,增殖能力強(qiáng),適宜作為種子細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。 2、外源性透明質(zhì)酸對MSCs增殖及分化情況的影響 目的：通過研究外源性透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, Mscs)體外增殖及定向分化為軟骨細(xì)胞的影響,探討關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境對Mscs的作用,為Mscs為基礎(chǔ)的組織工程化軟骨的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法：全骨髓法+貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)兔Mscs,取第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入HA誘導(dǎo)液(含0.25mg/ml HA+含10%FBS的HG-DMEM),以TGF-β3誘導(dǎo)組作為陽性對照,陰性對照組加入常規(guī)培養(yǎng)液。分別于誘導(dǎo)后第7、14、21d行甲苯胺藍(lán)染色檢測蛋白聚糖表達(dá),免疫組化染色及RT-PCR檢測細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)。 結(jié)果：經(jīng)HA誘導(dǎo)后,細(xì)胞增殖速度減慢,由長梭形變?yōu)槎嘟切巍E圓形,細(xì)胞外基質(zhì)呈甲苯胺藍(lán)異染性和Ⅱ型膠原免疫組化陽性,RT-PCR檢測示Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)陽性,表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞的分化特點(diǎn),但表達(dá)均比陽性對照組弱。 結(jié)論：外源性HA具有誘導(dǎo)兔Mscs向軟骨細(xì)胞分化的能力,但比TGF-β3的誘導(dǎo)能力弱。提示關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境對Mscs向軟骨細(xì)胞分化有正性促進(jìn)作用,支持HA作為軟骨組織工程基質(zhì)使用。 3、不同濃度透明質(zhì)酸對骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的影響 目的：探討不同濃度透明質(zhì)酸對骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨方向定向分化的影響。 方法：取P3代未誘導(dǎo)的骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞,按培養(yǎng)液中添加的透明質(zhì)酸濃度不同分為兩實(shí)驗(yàn)組,A組：低濃度組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HA0.1mg/m1),B組：高濃度組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HA0.2mg/m1)。同時(shí)設(shè)立空白對照組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)及陽性對照組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10ng/ml TGF-β3),觀察細(xì)胞形態(tài),增殖情況并繪制生長曲線,分別于誘導(dǎo)后第7、14、21d行免疫組化染色及RT-PCR檢測細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)。 結(jié)果：經(jīng)添加軟骨誘導(dǎo)劑后,干細(xì)胞細(xì)胞增殖速度放緩,形態(tài)由長梭形變?yōu)槎嘟切�、橢圓形,胞漿Ⅱ型膠原免疫組化陽性,RT-PCR檢測示Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)陽性,表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞的分化特點(diǎn),半定量分析顯示兩實(shí)驗(yàn)組Ⅱ型膠原表達(dá)無差異,但均比陽性對照組弱,空白對照組無Ⅱ型膠原表達(dá)。 結(jié)論：不同濃度外源性HA誘導(dǎo)兔Mscs向軟骨細(xì)胞分化的能力無差異,且均比TGF-β3的誘導(dǎo)能力弱。提示HA作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,有促進(jìn)Mscs向軟骨細(xì)胞分化的作用,但改變外環(huán)境中透明質(zhì)酸濃度不會(huì)影響Mscs的軟骨分化。自體關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境支持以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程化軟骨修復(fù)軟骨缺損。 4、不同分-子-量透明質(zhì)酸對骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的影響 目的：探討不同分子量透明質(zhì)酸對骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨方向定向分化的影響。 方法：取P3代未誘導(dǎo)的骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞,培養(yǎng)液中分別添加不同分子量透明質(zhì)酸做誘導(dǎo)劑,分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組,A組：低分子量組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HA0.1mg/ml,平均分子量約1000kD),B組：中分子量組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HA0.1mg/ml,平均分子量約1800kD),高分子量組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HA0.1mg/m1,平均分子量約2000kD)。同時(shí)設(shè)立空白對照組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)及陽性對照組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10ng/ml TGF-β3),觀察細(xì)胞形態(tài),增殖情況并繪制生長曲線,分別于誘導(dǎo)后第7、14、21d行甲苯胺藍(lán)染色檢測蛋白聚糖表達(dá),另外采用免疫組化染色及RT-PCR方法檢測細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)。 結(jié)果：經(jīng)添加軟骨誘導(dǎo)劑后,干細(xì)胞細(xì)胞增殖速度放緩,形態(tài)由長梭形變?yōu)槎嘟切�、橢圓形,細(xì)胞外基質(zhì)呈甲苯胺藍(lán)異染性,胞漿Ⅱ型膠原免疫組化陽性,RT-PCR檢測示Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)陽性,表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞的分化特點(diǎn),半定量分析顯示實(shí)驗(yàn)組Ⅱ型膠原表達(dá)與對照組有差異,但B、C組間Ⅱ型膠原表達(dá)相似,空白對照組無Ⅱ型膠原表達(dá)。 結(jié)論：不同分子量外源性HA誘導(dǎo)兔Mscs向軟骨細(xì)胞分化的能力存在差異,分子量高的HA的誘導(dǎo)能力較低分子量HA的誘導(dǎo)能力強(qiáng)。證明透明質(zhì)酸的分子量與Mscs的軟骨分化有關(guān)聯(lián)性,但均比TGF-β3的誘導(dǎo)能力弱。提高關(guān)節(jié)腔內(nèi)透明質(zhì)酸分子量對干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程化軟骨修復(fù)軟骨缺損有幫助。 5、外源性透明質(zhì)酸誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究 目的：探討外源性透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)對全層軟骨缺損修復(fù)的效果,了解體內(nèi)條件下經(jīng)外源性透明質(zhì)酸誘導(dǎo)的干細(xì)胞能否保持軟骨分化表型,促進(jìn)軟骨修復(fù)。 方法：4月齡日本大耳白兔24只,用手搖鉆制成直徑5mm、深4mm的圓柱形膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。分四組分別植入藻酸鹽凝膠混合的經(jīng)透明質(zhì)酸誘導(dǎo)后兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(組A,n=6),藻酸鹽凝膠混合的未經(jīng)誘導(dǎo)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(組B,n=6),單純藻酸鹽凝膠組(組C,n=6),及缺損處不處理(組D,n=6)。術(shù)后5、8和12周觀察軟骨缺損修復(fù)情況,進(jìn)行組織學(xué)評分。HE染色觀察軟骨細(xì)胞情況,RT-PCR檢測修復(fù)組織中Ⅱ型膠原mRNA合成情況。 結(jié)果：術(shù)后第8周,A組及B組與其他組比較,缺損處軟骨充填較好,與正常軟骨結(jié)合緊密,融合良好,組織學(xué)評分有差異,但A組與B組間評分無差異。至第12周,可見A組及B組關(guān)節(jié)面平滑,結(jié)合緊密,與周圍軟骨結(jié)合良好,移植物界限基本消失。大體評分A組、B組均優(yōu)于其他組,且A組與B組間差異有顯著性。組織學(xué)觀察顯示,修復(fù)組織A組類似透明軟骨,B組接近纖維軟骨,C組與D組細(xì)胞以纖維組織為主。PCR檢測僅在A、B兩組中見Ⅱ型膠原mRNA合成,且A組RNA表達(dá)優(yōu)于B組。 結(jié)論：體外經(jīng)外源性透明質(zhì)酸誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)較好保持了軟骨細(xì)胞形態(tài)與功能,有較好的修復(fù)軟骨缺損的能力。未經(jīng)誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)關(guān)節(jié)腔環(huán)境的綜合影響下可向軟骨形態(tài)分化,也擁有一定的軟骨修復(fù)能力,但這種能力明顯遜于已誘導(dǎo)干細(xì)胞。經(jīng)誘導(dǎo)的干細(xì)胞的成軟骨能力隨時(shí)間遷移逐漸明顯。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1683680