本文選題：發(fā)育　切入點：傳導系心肌　出處：《山西醫(yī)科大學》2012年博士論文

【摘要】：竇房結(jié)、房室結(jié)、房室束及左右束支構(gòu)成心臟中樞傳導系統(tǒng),左右束支的遠側(cè)分支及Purkinje纖維網(wǎng)構(gòu)成心臟周圍傳導系統(tǒng)。隨著發(fā)育生物學和分子遺傳學的快速發(fā)展,應(yīng)用細胞標記、原位雜交、轉(zhuǎn)基因和基因敲除等技術(shù)對不同種屬動物傳導系的發(fā)育做了大量研究,但由于傳導系發(fā)育的復雜性及不同動物的種屬差異性,對傳導系各組成部分的起源及發(fā)育機制尚存在許多爭議。探討胚胎心臟傳導系的發(fā)育機理不但是重要的基礎(chǔ)理論研究,也可為探討由于傳導系發(fā)育異常導致的先天性心臟病的發(fā)病機理提供理論依據(jù),對此類先天性心臟病的預(yù)防和治療有重要的意義,同時為研究成體心律失常發(fā)生機制的胚胎學起源提供一定的理論基礎(chǔ)。 竇房結(jié)是正常心律的起搏點,竇房結(jié)產(chǎn)生的興奮經(jīng)傳導系傳導至心房和心室的普通工作心肌,上作心肌的興奮引起心房和心室的收縮,完成心臟射血過程。心臟傳導系心肌和工作心肌的分化受不同的基因程序調(diào)控,表達不同的與功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。日前,對傳導系心肌、工作心肌發(fā)育的研究多集中在基因轉(zhuǎn)錄水平和對敲、轉(zhuǎn)基因小鼠的研究,而對這些基因所編碼的蛋白在正常胚胎心臟傳導系心肌和工作心肌發(fā)育過程中的時空表達規(guī)律研究甚少。 由于人胚胎標本缺乏,對人胚心臟傳導系發(fā)育研究甚少,主要限于形態(tài)學的描述或非特異性標記蛋白,如神經(jīng)組織抗原G1N2和HNK-1在C14期以后較大胚齡人胚心臟傳導系心肌的表達,對早期人胚心臟傳導系的發(fā)育缺乏系統(tǒng)研究。對轉(zhuǎn)基因和基因敲除的小鼠研究表明,多種轉(zhuǎn)錄因子和離子通道蛋白參與了小鼠心臟傳導系的發(fā)育。這些轉(zhuǎn)錄因子和離子通道蛋白是否在人胚心臟傳導系發(fā)育過程中也發(fā)揮同樣的調(diào)控作用尚不清楚。 本實驗第一章通過觀察心肌肌球蛋白重鏈(MHC)、超級化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道蛋白4(HCN4)、縫隙連接蛋白43(Cx43)和平足蛋白(PODOPLANIN)在胚齡9d-16d小鼠胚胎心臟的表達特征,探討HCN4、Cx43和PODOPLANIN在小鼠胚胎心臟的表達規(guī)律與小鼠心臟傳導系的發(fā)生。第二章通過觀察縫隙連接蛋白43(Cx43)在胚齡9d-17d小鼠胚胎心臟的陽性和陰性表達特征,結(jié)合免疫印跡法檢測胚齡11d、13d、15d、16d和17d小鼠胚胎心臟組織中Cx43蛋白含量,探討Cx43在小鼠胚胎心臟的時空表達模式與心臟傳導系心肌及工作心肌發(fā)育的關(guān)系。第三章通過觀察MHC、HCN4、結(jié)蛋白(Desmin)、轉(zhuǎn)錄因子TBX3、轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和轉(zhuǎn)錄因子ISL-1在C9～C16期人胚心臟的表達規(guī)律,探討甲期人胚心臟傳導系的發(fā)育機理。 第一章HCN4、Cx43和PODOPLANIN在小鼠胚胎心臟的表達與心臟傳導系的發(fā)生 用抗心肌肌球蛋白重鏈(MHC)、抗超級化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道蛋白4(HCN4)、抗縫隙連接蛋白43(Cx43)和抗平足蛋白(PODOPLANIN)抗體對40只胚齡9d-16d小鼠胚胎心臟連續(xù)石蠟切片進行免疫組織化學或免疫熒光染色,觀察HCN4、Cx43和PODOPLANIN在小鼠胚胎心臟的表達規(guī)律與小鼠心臟傳導系的發(fā)生。結(jié)果顯示：胚齡9d,較強的HCN4陽性染色出現(xiàn)在MHC表達較弱或陰性的心房和靜脈竇壁。胚齡10d,靜脈竇右角管壁顯示較強的HCN4陽性表達。胚齡lld-16d,隨竇房結(jié)的形成并發(fā)育,較強的HCN4陽性表達逐漸向竇房結(jié)轉(zhuǎn)移,而心臟其它部位的HCN4陽性表達逐漸下降。胚齡11d開始,Cx43陰性表達顯示部位特異性：Cx43陰性染色從心房背側(cè)壁沿房間隔與房室管腹側(cè)壁相連；Cx43陰性染色從竇房結(jié)沿左、右靜脈瓣和心房背側(cè)壁心肌向房室管背側(cè)壁延伸；胚齡13d,左、右靜脈瓣相繼與房間隔底部融合后,Cx43陰性染色進一步沿右側(cè)靜脈瓣、冠狀竇口及背側(cè)間充質(zhì)突的前方,延續(xù)為房室管背側(cè)壁Cx43陰性的房室結(jié),繼而與室間隔頂部Cx43陰性的房室束相連。胚齡9d-10d,在MHC陽性心肌和MHC陰性的心包腔背側(cè)壁臟壁中胚層及靜脈竇周間充質(zhì)細胞均顯示PODOPLANIN陽性表達。胚齡11d-13d, PODOPLANIN陽性間充質(zhì)細胞沿心臟外表面擴展形成PODOPLANIN陽性間皮樣心外膜。胚齡14d后,PODOPLANIN在心外膜的表達消失,在MHC陽性的大部分心肌表達下降,PODOPLANIN較強陽性表達局限在心房小梁心肌、束支及相連的心室部分小梁心肌。由此我們認為：在小鼠胚胎發(fā)育早期,較強的HCN4陽性表達位于靜脈竇,隨發(fā)育,逐漸向竇房結(jié)轉(zhuǎn)移,與電生理研究發(fā)現(xiàn)的主起搏點在胚胎心臟的轉(zhuǎn)移路徑相吻合。在小鼠胚胎發(fā)育第11天即可觀察到Cx43陰性心肌構(gòu)成的發(fā)育中的心臟傳導系的早期雛形。PODOPLANIN促進心肌前體細胞分化為心肌細胞,參與胚胎發(fā)育早期心肌和部分工作心肌和傳導系心肌的形成。PODOPLANIN可能促進心外膜細胞向心肌層的遷移和分化。 第二章Cx43在小鼠胚胎心臟的時空表達模式與心臟傳導系心肌、工作心肌發(fā)育的關(guān)系 用抗縫隙連接蛋白43(Cx43)、抗心肌肌球蛋白重鏈(MHC)和抗橫紋肌肌節(jié)肌動蛋白(α-SCA)對45只胚齡9d-17d小鼠胚胎心臟連續(xù)切片進行免疫組織化學或免疫熒光染色,用免疫印跡(Western blotting)方法檢測胚齡l1d、13d、15d、16d和17d小鼠胚胎心臟組織中Cx43蛋白含量,觀察縫隙連接蛋白Cx43在小鼠胚胎心臟的時空表達模式與心臟傳導系心肌、工作心肌發(fā)育的關(guān)系。結(jié)果顯示：胚齡9d-lOd,Cx43弱陽性表達首先出現(xiàn)在左心室腹側(cè)壁及原始小梁心肌。胚齡11d以后,Cx43在心房、心室的陽性表達范圍逐漸擴大,陽性表達強度逐漸增強。胚齡lld-16d,Cx43陽性染色依次出現(xiàn)在心房的頂部、前壁、外側(cè)壁和小梁心肌等部位,在心室,Cx43陽性染色從心尖部逐漸擴展至左、右心室的小梁心肌和致密心肌,而在竇房結(jié)中央、左右靜脈瓣、房間隔、右心房背側(cè)壁、房室管及發(fā)育中的房室結(jié)和房室束均未見Cx43陽性染色,構(gòu)成發(fā)育中的心臟傳導系雛形。胚齡17d,Cx43在左右靜脈瓣、房間隔及右心房背側(cè)壁的陰性染色轉(zhuǎn)為Cx43弱陽性染色,僅在竇房結(jié)、房室結(jié)、房室束等部位保持Cx43陰性染色。較強的Cx43陽性染色沿室間隔兩側(cè)左、右束支延續(xù)至左、右心室小梁心肌。至此,Cx43陰性心肌構(gòu)成胚胎心臟中樞傳導系,而Cx43陽性心肌構(gòu)成胚胎心臟周圍傳導系心肌和工作心肌。免疫印跡結(jié)果顯示,胚齡11d-17d,Cx43蛋白在胚胎心臟的含量隨發(fā)育逐漸增多。由此我們認為：Cx43在心房和心室陽性表達不斷擴展,表明心房和心室原始心肌細胞向工作心肌細胞分化。Cx43陰性心肌和Cx43陽性的周圍傳導系心肌共同構(gòu)成胚胎心臟完整的傳導系。在心臟發(fā)育晚期,心房傳導系心肌范圍逐漸縮小,而工作心肌范圍逐漸擴大。Cx43在胚胎心臟的時空表達模式與心臟傳導系心肌、工作心肌的正常發(fā)育和興奮傳導功能相適應(yīng)。 第三章人胚心臟傳導系的早期發(fā)育 用抗心肌肌球蛋白重鏈(MHC)、抗超級化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道蛋白4(HCN4)、抗結(jié)蛋白(Desmin,DES)、抗轉(zhuǎn)錄因子TBX3、抗轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和抗轉(zhuǎn)錄因子ISL-1抗體對27例C9-C16期(Carnegie stage9～Carnegie stage16,排卵后20+1-37天)人胚心臟連續(xù)石蠟切片進行免疫組織化學染色,探討早期人胚心臟傳導系的發(fā)育機制。結(jié)果顯示：人胚C9-C10期,TBX3在原始心管表達廣泛。Cll期開始,TBX3在心管不同部位的表達強度出現(xiàn)差異。C11-C16期,TBX3較強陽性表達逐漸局限在發(fā)育中的竇房結(jié)、左右靜脈瓣、房室管、房室結(jié)、室間隔頂部發(fā)育中的房室束及束支等部位。連續(xù)切片觀察：較強的TBX3陽性染色經(jīng)房室管壁向心房側(cè)經(jīng)右側(cè)靜脈瓣延伸至發(fā)育中的竇房結(jié)；向心室側(cè),經(jīng)房室管右側(cè)壁延續(xù)至室間隔頂部發(fā)育中的房室束和左右束支。較強的DES陽性染色首先出現(xiàn)在C10期人胚心臟房室管右側(cè)壁,隨發(fā)育,DES陽性染色擴展至發(fā)育中的竇房結(jié)、左右靜脈瓣、房室管、房室結(jié)、房室束及束支等部位,和TBX3顯相同的表達模式。DES較強陽性染色還出現(xiàn)在心房背側(cè)壁、冠狀竇和心室腔而小梁心肌。人胚C10-C13期,心管尾端的靜脈竇左、右角發(fā)育不平衡,靜脈竇右角Nkx2.5和MHC陰性表達,但顯示第二生心區(qū)標記蛋白ISL-1陽性染色,而靜脈竇左角表達較強的Nkx2.5和MHC,已失去ISL-1陽性表達。人胚C14期,近右心房的右上腔靜脈右側(cè)壁增厚,形成形態(tài)可辨的ISL-1、DES陽性、Nkx2.5陰性的竇房結(jié)原基,TBX3在竇房結(jié)的表達從鄰近右側(cè)靜脈瓣局部不斷向遠端擴展。人胚C9期,HCN4在原始心管心肌均顯示弱陽性表達。人胚C10-C13期,HCN4陽性染色從流出道、心室、房室管和心房延仲至靜脈竇左、右角,且從心管動脈端到靜脈端的陽性染色逐漸增強,在Nkx2.5陽性的靜脈竇左角壁的表達明顯強于Nkx2.5陰性的靜脈竇右角壁。人胚C14-C16期,隨著竇房結(jié)和靜脈瓣等結(jié)構(gòu)在靜脈端右側(cè)形成,HCN4在心房、心室心肌陽性表達逐漸減弱,HCN4較強陽性逐漸局限于竇房結(jié)和靜脈瓣等部位。由此我們認為：TBX3陽性表達確定早期人胚心臟中樞傳導系。DES標記人胚早期傳導系,包括發(fā)育中的中樞傳導系和周圍傳導系。HCN4在人胚心臟的時空表達規(guī)律為電生理研究發(fā)現(xiàn)的主起搏點的轉(zhuǎn)移路徑提供了形態(tài)學證據(jù)。Nkx2.5表達陰性是保證竇房結(jié)在靜脈端右側(cè)正常發(fā)育的必要的基因調(diào)控機制。成體心律失常的發(fā)生部位具有特定的胚胎學起源。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R331

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本文編號：1680050