本文選題：B細胞活化因子　切入點：基因克隆　出處：《濟南大學》2012年碩士論文

【摘要】：B細胞活化因子(B cell activating factor belonging to the TNF family, BAFF)是腫瘤壞死因子配體家族的新成員，，是調(diào)節(jié)B細胞免疫的重要細胞因子；在體內(nèi)，它以膜結(jié)合型和可溶型兩種活性形式存在，可溶性蛋白由152個氨基酸(134~285)組成，是膜結(jié)合型的BAFF在體內(nèi)蛋白酶的作用下水解釋放得到的胞外區(qū)片段，也是其發(fā)揮功能的主要區(qū)域。BAFF作為一種B淋巴細胞共刺激因子，能夠促進B細胞增殖、活化、分化及抗體的產(chǎn)生，延長B細胞的存活；在BAFF轉(zhuǎn)基因鼠，出現(xiàn)類似人系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus, SLE)和Sj gren’s綜合征等自身免疫病的表現(xiàn)；BAFF過表達也在SLE、類風濕性關節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）、Sj gren’s綜合征和一些B細胞腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)。因此，BAFF作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子，在維持B細胞動態(tài)平衡中發(fā)揮關鍵作用；BAFF的異常表達在B細胞惡性增殖性疾病和異常活化性疾病中發(fā)揮重要的致病作用。BAFF可與BAFF-R、TACI和BCMA三個受體特異性結(jié)合而發(fā)揮其生物學作用，其中BAFF-R是其特異受體，只能與BAFF結(jié)合，BAFF-R與BAFF之間的親和力遠大于其它兩個受體。另外，研究發(fā)現(xiàn)，BAFF的受體不僅在正常B細胞上表達，而且在淋巴瘤和自身免疫病等惡性B細胞和異常增殖的B細胞有較高水平的表達。BAFF受體表達的細胞特異性，提示BAFF及其受體可作為B細胞惡性增殖性疾病和異�；罨约膊〉闹匾臐撛谥委煱悬c。 目的 鑒于BAFF及其受體有望成為治療相關性疾病的新靶點。為此我們根據(jù)編碼人sBAFF氨基酸的核苷酸序列，對其cDNA序列進行人工突變，得到了可溶性突變體BAFF(soluble mutant BAFF, smBAFF)編碼序列，構建了相應重組表達質(zhì)粒，表達、純化了重組人smBAFF(recombinant human smBAFF, rh-smBAFF)。通過rh-smBAFF與BAFF競爭性結(jié)合BAFF受體的初步研究，探討其作為BAFF拮抗劑治療B細胞淋巴瘤和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等B細胞異常增生活化性疾病的可行性。 方法 1. rh-smBAFF基因合成和克隆：根據(jù)BAFF蛋白質(zhì)結(jié)構及功能域分析和大腸桿菌密碼子偏性，合成人smBAFF基因并克隆至pUC57獲得重組載體pUC57-smBAFF。依據(jù)smBAFF基因序列設計包含Nde I和Xho I位點的特異性引物，經(jīng)PCR擴增得到目的基因片段，將目的基因片段插入到pMD19-T克隆載體，構建重組克隆質(zhì)粒pMD19-T/smBAFF。行菌落PCR篩選及酶切鑒定陽性克隆，對目的基因片段進行DNA序列測定。 2.表達載體的構建和鑒定：純化重組克隆質(zhì)粒pMD19-T/smBAFF，經(jīng)Nde I和Xho I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離并純化smBAFF基因片段，將其插入到經(jīng)相應酶切的表達載體pQE-T7-2上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR鑒定陽性重組表達質(zhì)粒。 3. rh-smBAFF的表達鑒定：重組質(zhì)粒pQE-T7-2/smBAFF轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)菌株，挑取單克隆菌落擴增至對數(shù)生長期，經(jīng)IPTG誘導后，SDS-PAGE分析和Western blot鑒定重組蛋白。 4. rh-smBAFF表達形式的鑒定：大量誘導表達rh-smBAFF，分別收集細菌裂解上清和包涵體沉淀，行SDS-PAGE分析蛋白表達形式。 5. rh-smBAFF純化：在變性條件下采用Ni2+-NTA親和層析法對目的蛋白進行純化，行SDS-PAGE分析目的蛋白純度，變性的目的蛋白經(jīng)尿素濃度逐漸降低透析液透析復性，超濾濃縮目的蛋白。 6.受體結(jié)合實驗：用免疫熒光技術檢測rh-smBAFF與B淋巴細胞結(jié)合能力。 7.細胞增殖實驗：用CCK-8法檢測rh-smBAFF對sBAFF促B細胞增殖的競爭抑制作用。 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果 1. rh-smBAFF表達載體、菌株的構建：優(yōu)化的人smBAFF基因序列經(jīng)序列分析與預期一致。插入原核表達載體pQE-T7-2，構建了原核表達質(zhì)粒pQE-T7-2/smBAFF。原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導、SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示誘導后的重組菌株在17KDa處出現(xiàn)明顯蛋白條帶，與目的蛋白的大小相同，經(jīng)凝膠圖像掃描分析顯示目的蛋白約占菌體總蛋白的40%。Western blot結(jié)果顯示重組蛋白與抗人BAFF多克隆抗體和抗His-Tag多克隆抗體均能發(fā)生特異性反應，表明獲得的重組蛋白為特異性smBAFF蛋白。 2. rh-smBAFF的分離純化：重組菌株擴增、IPTG誘導，分離細菌裂解上清和包涵體，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，重組蛋白主要位于包涵體中。變性裂解包涵體，經(jīng)Ni2+-NTA親和層析法純化目的蛋白，行SDS-PAGE和凝膠圖像掃描分析，smBAFF蛋白純度達90%以上。 3. rh-smBAFF特異性結(jié)合B細胞：細胞免疫熒光顯示，重組smBAFF蛋白能與B細胞表面受體有特異性結(jié)合能力。 4. rh-smBAFF對sBAFF促B細胞增殖的抑制作用：經(jīng)CCK-8法檢測顯示，rh-smBAFF失去刺激B細胞增殖的作用，且能抑制sBAFF對B細胞增殖的刺激作用。 結(jié)論 成功構建了rh-smBAFF原核表達載體和高效穩(wěn)定表達工程菌株；純化的重組蛋白rh-smBAFF無B細胞增殖活性但保留了良好的B細胞結(jié)合活性，且具有競爭性抑制sBAFF促進B細胞增殖的作用，為其作為靶向載體在B細胞惡性增殖性疾病及自身免疫性疾病治療中的應用提供了實驗依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392.12

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