本文選題：高濃度氧　切入點：肺泡上皮細胞　出處：《蘇州大學》2012年博士論文

【摘要】：目的：建立高濃度氧誘導在體大鼠肺泡細胞凋亡損傷模型，觀察短時間內(nèi)（4～8小時）吸入高濃度氧肺泡上皮細胞的損傷；觀察一氧化氮及其合酶對急性吸入高濃度氧導致大鼠肺泡上皮細胞凋亡的影響；探討線粒體途徑和細胞酸化在氧化應激早期誘導的肺泡上皮細胞凋亡信號傳導過程中的作用。 方法：WISTAR大鼠放至于氧濃度為80－100％的氧箱中4、8、12、16小時，空氣對照組放置于氧濃度為21％的氧箱中，實驗分三部分，按實驗目的不同制取樣本做如下測試:1.比色法測定血漿、肺組織勻漿中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶(SOD）、谷光甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）和總抗氧化能力（T-AOC）；HE染色觀察肺組織常規(guī)病理變化，TUNEL染色法檢測肺泡表面凋亡細胞；2. Western blot檢測肺組織中eNOS和iNOS蛋白表達，RT-PCR檢測eNOSmRNA、iNOSmRNA的表達。3. RT-PCR檢測bcl-2mRNA、baxmRNA、eNOSmRNA、iNOSmRNA的表達，Western blot檢測bcl-2、bax、 Akt1/磷酸化-Akt1、mTOR/磷酸化-mTOR的蛋白表達；BCECF-AM檢測細胞漿pH值，流式細胞儀(Flowcytometry,FCM)檢測細胞增殖指數(shù)。 結果：1.與對照組相比（凋亡2.17%），吸入高濃度氧4小時即出現(xiàn)典型的肺泡表面凋亡細胞(9.13±3.2％)，8～12小時組凋亡細胞的數(shù)量明顯增加(17.47±3.5％、19.22±4.5％)，16小時組有減少的趨勢(11.03±2.8％)。HE染色切片顯示4小時組肺輕度充血，8小時組肺毛細血管擴張、充血、紅細胞滲出、輕度肺水腫。16小時組開始出現(xiàn)以中性粒細胞為主的炎癥細胞,肺組織水腫明顯、肺大泡和肺不張，甚至可見肺組織增生、結構紊亂。各組血清、肺組織勻漿MDA、NO、NOS顯著升高（P＜0.01），而SOD、GSH、CAT、T-AOC均顯著降低（P＜0.01）。2. Westenblot檢測發(fā)現(xiàn)，高氧4h組eNOS表達開始升高，8h、12h組后eNOS蛋白質(zhì)表達升高明顯,16h組高表達但略有下降；高氧各組eNOSmRNA表達顯著增高。對照組iNOS蛋白微量表達,與對照組比較，4h、8h、12h組表達無顯著差異，表達量遠低于eNOS,16h組表達略增強；iNOSmRNA的表達在16h組表達也增強。3.RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)吸氧各組bcl-2mRNA表達明顯降低，baxmRNA表達顯著增高；Western blot檢測Bax蛋白表達逐漸增強，Bcl-2蛋白、AKT-1/PhosphoAkt-1(Ser473)蛋白、mTOR/Phospho-mTOR蛋白表達逐漸減弱；高氧氧應激后大鼠肺泡上皮細胞Akt/PKB蛋白磷酸化程度都降低，隨吸氧時間延長，Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導蛋白表達降低更加明顯；BCECF-AM檢測細胞漿pH值顯示隨著吸氧時間的延長，體內(nèi)ROS水平的不斷升高，F(xiàn)L1/FL2比值不斷降低，凋亡的比例也不斷增加。各時段細胞酸化均較顯著，各組細胞增殖改變和細胞漿酸性變化趨勢相一致。 結論：1．大鼠活體急性高氧氧應激模型實驗發(fā)現(xiàn)，短時間吸入高濃度氧導致急性氧應激時即可導致肺泡上皮細胞凋亡顯著增加，且隨著吸氧時間的延長損傷加重，損傷轉(zhuǎn)為向炎癥表現(xiàn)發(fā)展。2．氧應激凋亡早期（4-8h）NO大幅升高由eNOS表達增強引起的。16h iNOS和iNOSmRNA表達略增強，但并不高，炎性表現(xiàn)不明顯，說明炎性細胞功能還未被完全激活。3.線粒體膜通透性改變和線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道的開放，BCL-2/BAX減小，AKT/mTOR及其磷酸化表達均減少，導致PI3/Akt/mTOR信號途徑轉(zhuǎn)導異常，說明了高氧氧應激早期線粒體途徑應是肺泡上皮細胞凋亡的主要信號傳導路徑。4.高氧氧應激后ROS同時損傷了溶酶體膜的穩(wěn)定性，，溶酶體內(nèi)活性物質(zhì)的釋放導致線粒體損傷更加嚴重，促使溶酶體參與的線粒體途徑的細胞凋亡機制的發(fā)生。但這種早期損傷還尚未啟動其他如自噬等炎性生理反應，僅凋亡現(xiàn)象表現(xiàn)的非常明顯。5.通過實驗觀察提示氧化應激誘導肺泡上皮細胞凋亡與細胞漿酸化有關，ROS通過直接損傷了細胞質(zhì)膜抑制Na+/H+交換使細胞內(nèi)酸化，或者損傷溶酶體膜，釋放大量H+進入細胞漿，導致細胞酸化，這有利于細胞內(nèi)酸性核酸內(nèi)切酶等生物活性物質(zhì)發(fā)揮作用，誘導凋亡。細胞漿酸化程度與細胞凋亡發(fā)生率存在某種量效關系，細胞酸化既可能是細胞凋亡的伴隨現(xiàn)象，同時又可能導致線粒體、溶酶體損傷，加重線粒體-溶酶體途徑引起的細胞死亡，其機制有待于進一步研究。 本實驗利用大鼠在體活細胞實驗，吸入氧濃度與臨床全麻使用氧濃度相同，時間相近，實驗結果提示臨床使用純氧存在安全隱患，但這種損傷尚處于早期階段。但隨著吸氧時間的延長，損傷趨于炎性化，程度會加重。其損傷機理還不十分清楚，有待進一步研究。
[Abstract]:Objective: to establish a high concentration of oxygen induced apoptosis in rat alveolar injury model, observed in a short period of time (4~8 hours) high concentration oxygen inhalation injury were observed in alveolar epithelial cells; nitric oxide and nitric oxide synthase on acute inhalation of high concentration of oxygen leads to apoptosis of rat alveolar epithelial cells; to investigate the mitochondrial pathway and cell apoptosis in acidizing the signal transduction process of alveolar epithelial cells induced by oxidative stress in the early stage.
Methods: WISTAR rats as the oxygen concentration of oxygen in the 4,8,12,16 box 80 - 100% hours, air control group placed on the oxygen concentration of oxygen tank 21%, the experiment was divided into three parts, the following test according to different experimental purposes: 1. samples for colorimetric determination of plasma and lung homogenate (C two aldehyde MDA), superoxide dismutase (SOD), glutathione (GSH), catalase (CAT), nitric oxide (NO), nitric oxide synthase (NOS) and total antioxidant capacity (T-AOC); observe the pathological changes of lung tissue HE staining, TUNEL staining method to detect lung surface global cell apoptosis; detection of lung tissue 2. Western blot expression of eNOS and iNOS protein, RT-PCR eNOSmRNA detection, RT-PCR detection of bcl-2mRNA expression of.3., iNOSmRNA baxmRNA, eNOSmRNA iNOSmRNA, Western blot expression, bcl-2 detection, Bax, phosphorylation of Akt1/ -Akt1 expression, mTOR/ phosphorylation of -mTOR protein was detected by BCECF-AM; The pH value of plasma and Flowcytometry (FCM) were used to detect the cell proliferation index.
Results: 1. compared with the control group (2.17% apoptosis), high concentration oxygen inhalation for 4 hours, the cell apoptosis of the alveolar surface (9.13 + 3.2%), the number of apoptotic cells in 8~12 hour group increased significantly (17.47 + 3.5%, 19.22 + 4.5%), 16 hours group decreased (11.03 + 2.8%).HE the 4 hour group lung staining showed mild congestion, 8 hours group of pulmonary capillary dilation, hyperemia, extravasation of red blood cells and mild pulmonary edema.16 hours group began to appear in neutrophils in inflammatory cells, pulmonary edema, pulmonary bulla and atelectasis, disorder or even visible lung tissue, structure. Serum. Lung tissue homogenate MDA, NO, NOS were significantly increased (P < 0.01), while SOD, GSH, CAT, T-AOC were significantly decreased (P < 0.01).2. Westenblot detection, high oxygen group 4h eNOS expression began to increase, 8h, 12h group after the expression of eNOS protein in 16h group increased significantly, but slightly higher expression The high oxygen groups decreased; the expression of eNOSmRNA was significantly increased. The control group iNOS protein expression, compared with the control group, 4h, 8h, 12h group was no significant difference, the expression is much lower than that of eNOS, 16h expression was slightly enhancement; the expression of iNOSmRNA in group 16h also enhanced.3.RT-PCR detected oxygen group bcl-2mRNA decreased obviously. The expression of baxmRNA was significantly increased; to detect the expression of Bax protein Western blot gradually increased, Bcl-2 protein, AKT-1/PhosphoAkt-1 (Ser473) protein, mTOR/Phospho-mTOR protein expression decreased gradually; high oxygen stress in rat alveolar epithelial cells Akt/PKB protein phosphorylation are decreased with the oxygen time prolonged, the expression of Akt/mTOR signal transduction protein significantly decreased; BCECF-AM detection cytoplasm pH value showed that with prolonging the time of oxygen inhalation, the level of serum ROS increased, FL1/FL2 ratio decreased, apoptosis ratio is also increasing The acidification of cells in each period was significant, and the changes of cell proliferation and plasma acidity were the same in each group.
Conclusion: 1. rats in acute hyperoxia induced oxidative stress model experiment, short time inhalation of high concentration of oxygen leads to acute oxidative stress can lead to apoptosis of alveolar epithelial cells was significantly increased, and with the time prolonging oxygen damage, damage to the development of inflammation.2. oxygen stress early apoptosis (4-8h) NO significantly increased iNOS induced.16h and iNOSmRNA expression was slightly enhanced by eNOS expression, but not high, inflammatory performance is not obvious, that inflammatory cell function has not been fully activated.3. mitochondrial membrane permeability and mitochondrial permeability transition pore opening, BCL-2/BAX decreased, AKT/mTOR expression and phosphorylation were reduced, resulting in abnormal PI3/Akt/mTOR signal transduction pathway. The high oxygen stress early mitochondrial pathway is the main signal transduction of apoptosis of alveolar epithelial cells in high oxygen stress path.4. ROS and damage the fibrinolytic enzyme The stability of membrane and soluble active substance in vivo enzyme release leads to mitochondrial damage is more serious, the apoptosis mechanism to promote the participation of the lysosomal mitochondrial pathway. But the early damage have yet to start other inflammatory reactions such as autophagy physiology, only apoptosis phenomenon is very obvious at the table.5. through the experimental observation that oxidative stress and induction the cytoplasm of alveolar epithelial cell apoptosis of ROS by direct acidification, damage the cell membrane to inhibit Na+/H+ exchange of intracellular acidification, or damage the lysosomal membrane and release large amounts of H+ into cells, leading to cell acidification, which facilitates intracellular acidic endonucleases and other bioactive substances play a role in inducing apoptosis and cell cytoplasm acidification. The occurrence of apoptosis there is a dose-response relationship, intracellular acidification can be associated with apoptosis, also may lead to mitochondrial, The damage of lysosome aggravates the cell death caused by the mitochondrial lysosome pathway, and its mechanism remains to be further studied.
This experiment using living cells of rats in vivo experiment, inhaled oxygen concentration and clinical anesthesia using the same oxygen concentration, similar to the time, the experimental results suggest that the clinical use of pure oxygen, there are security risks, but this damage is still in its early stages. With prolonging the time of oxygen inhalation injury, more inflammatory, will increase the degree of the damage mechanism also. Not very clear, needs further research.

【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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本文編號：1674316