本文選題：miR-210　切入點(diǎn)：BMMSCs　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的研究小分子非編碼RNA mi R-210對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)表達(dá)和分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的影響,為骨組織工程血管化研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法首先體外全骨髓液貼壁法培養(yǎng)小鼠BMMSCs,通過構(gòu)建慢病毒載體Lenti-Lac Z和Lenti-mi R-210,分別轉(zhuǎn)染小鼠BMMSCs和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC);MTT法檢測慢病毒載體對小鼠BMMSCs增殖情況的影響;Lenti-mi R-210/BMMSCs和Lenti-Lac Z/BMMSCs于轉(zhuǎn)染慢病毒載體后培養(yǎng)至第7d RT-PCR檢測VEGF m RNA基因表達(dá),第14d Western blot檢測VEGF蛋白表達(dá);通過PKH26紅色熒光染料對Lenti-mi R-210/HUVEC和Lenti-Lac Z/HUVEC進(jìn)行染色后,進(jìn)行24h Matrigel成管實(shí)驗(yàn),通過熒光顯微鏡觀察成管效果,統(tǒng)計(jì)兩組成管長度;構(gòu)建Hy Stem-HP凝膠緩釋系統(tǒng),agomir-210和agomir-NC與BMMSCs復(fù)合Hy Stem-HP凝膠后行裸鼠皮下注射,7d后取標(biāo)本進(jìn)行10%中性福爾馬林固定,脫水后包埋,石蠟切片行CD31免疫熒光染色,檢測CD31陽性細(xì)胞含量。使使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式呈現(xiàn),t檢驗(yàn)和方差分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。結(jié)果全骨髓液培養(yǎng)后5-7d,鏡下見部分細(xì)胞呈梭形或多角形,散在分布;傳代后貼壁細(xì)胞呈梭形旋渦狀生長,細(xì)胞形態(tài)隨傳代培養(yǎng)逐漸一致;mi R-210慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠BMMSCs和HUVEC,當(dāng)MOI=10時(shí),轉(zhuǎn)染效率最高,MTT法檢測病毒對BMMSCs增殖無影響,Lenti-mi R-210和Lenti-Lac Z兩組細(xì)胞培養(yǎng)第7dRT-PCR檢測VEGF m RNA基因表達(dá)結(jié)果,mi R-210促進(jìn)小鼠BMMSCs VEGF的表達(dá)(P0.01);第14d Western blot檢測兩組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá),mi R-210組VEGF蛋白表達(dá)明顯高于對照組,與RT-PCR結(jié)果一致;Matrigel成管實(shí)驗(yàn)24h結(jié)果Lenti-mi R-210組與Lenti-Lac Z相比,環(huán)形管狀結(jié)構(gòu)明顯,端端接觸多,管壁更完整;統(tǒng)計(jì)小管長度后比較兩組小管長度,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);agomir-210和agomir-NC分別與BMMSCs復(fù)合Hy Stem-HP凝膠緩釋系統(tǒng)裸鼠皮下注射7d后標(biāo)本CD31免疫熒光染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析顯示agomir-210組CD31陽性細(xì)胞含量明顯高于agomir-NC組,約是agomir-NC組的3倍。結(jié)論通過慢病毒載體,轉(zhuǎn)染小鼠BMMSCs,過表達(dá)目的基因mi R-210后能夠有效促進(jìn)小鼠BMMSCs VEGF的表達(dá)和分泌,agomir-210 Hy Stem-HP凝膠裸鼠皮下實(shí)驗(yàn)表明,agomir-210促進(jìn)BMMSCs微血管的形成。
[Abstract]:Objective to study the effect of small molecule noncoding RNA mi R-210 on the expression and secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF) in mouse bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs). Methods BMMSCs were cultured in vitro by whole bone marrow adherent method. The lentivirus vectors Lenti-Lac Z and Lenti-mi R-210 were constructed and transfected into mouse BMMSCs and human umbilical vein endothelial cells respectively. Effect of lentivirus vector on BMMSCs proliferation in mice Lenti-mi R-210/BMMSCs and Lenti-Lac Z/BMMSCs were transfected into lentivirus vector to detect the expression of VEGF m RNA gene by RT-PCR on the 7th day. On the 14th day, Western blot was used to detect the expression of VEGF protein, Lenti-mi R-210/HUVEC and Lenti-Lac Z/HUVEC were dyed with PKH26 red fluorescent dye, then the tube formation of Lenti-mi R-210/HUVEC and Lenti-Lac Z/HUVEC was carried out for 24 hours. The tube forming effect was observed by fluorescence microscope, and the length of the two components was counted. Hy Stem-HP gel sustained release system (Hy Stem-HP gel) was constructed. The Hy Stem-HP gel was combined with agomir-NC and BMMSCs. After 7 days of subcutaneous injection of Hy Stem-HP gel, 10% neutral formalin was fixed and embedded in paraffin sections of Hy Stem-HP gel. CD31 immunofluorescence staining was performed on paraffin sections. The content of CD31 positive cells was detected. The statistical analysis was carried out by using SPSS13.0 software. The experimental data presented t test and ANOVA in the form of mean 鹵standard deviation. Results after 5 to 7 days of whole bone marrow culture, some cells were spindle-shaped or polygonal and scattered, and the adherent cells grew like spindle-shaped swirls after passage. The morphology of mouse BMMSCs and HUVECs was consistent with the passage culture. When MOI = 10:00, the cells were transfected into murine BMMSCs and HUVECs. The expression of VEGF m RNA gene was detected by 7dRT-PCR in the two groups of BMMSCs proliferation and Lenti-Lac Z cell culture. The results showed that Mi R-210 promoted the expression of BMMSCs VEGF in mice (P0.01), and on day 14, Western blot was used to detect the expression of VEGF protein in both groups. The expression of VEGF protein in R- 210 group was significantly higher than that in control group. The results were consistent with the results of RT-PCR experiment for 24 h. Results compared with Lenti-Lac Z, the Lenti-mi R-210 group had obvious annular tubular structure, more end-end contact and more complete tube wall, and the length of the two groups was compared after statistics of the tubule length. The results of CD31 immunofluorescence staining showed that the content of CD31 positive cells in agomir-210 group was significantly higher than that in agomir-NC group. Conclusion the overexpression of the target gene mi R-210 can effectively promote the expression of BMMSCs VEGF and secretion of agomir-210Hy Stem-HP gel in nude mice. Conclusion the results of subcutaneous experiments show that agomir-210 can promote the formation of BMMSCs microvessels in nude mice after transfection of lentivirus vector into BMMSCs, and overexpression of the target gene mi R-210 can effectively promote the expression of BMMSCs VEGF and the secretion of agomir-210Hy Stem-HP gel.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R782

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本文編號：1653616