本文選題：β-arrestin2　切入點(diǎn)：血管緊張素Ⅱ受體　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2012年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)是體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)壓力和容量負(fù)荷的信號(hào)軸,作為終端壓力感受器之一的血管緊張素Ⅱ—型受體(AT1-R)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn),尤其是AT1-R在代償性的心室重構(gòu)所導(dǎo)致的心臟肥大和心力衰竭中發(fā)揮重要作用。臨床研究顯示,許多血管緊張素受體拮抗劑(ARB)類(lèi)藥物在血壓控制方面要優(yōu)于血管緊張素酶抑制劑(ACEI)類(lèi)藥物。我們?cè)缙诘膶?shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn),AT1-R可以不依賴(lài)于AngⅡ而獨(dú)立活化。例如,采用機(jī)械牽張(力學(xué)負(fù)荷)而不依賴(lài)于AngⅡ的方法,可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞產(chǎn)生肥厚現(xiàn)象；應(yīng)用升主動(dòng)脈縮窄(TAC)方法構(gòu)建壓力超負(fù)荷模型,也可誘發(fā)血管緊張素原基因敲除(ATG-/-)小鼠心室重構(gòu)及心力衰竭的發(fā)生。這種獨(dú)立于AngⅡ的AT1受體活化形式以及所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路目前尚不明確。然而,有越來(lái)越多的證據(jù)表明,機(jī)械應(yīng)力引起的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)活化,并不通過(guò)經(jīng)典的G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。故此,我們推測(cè)AT1-R作為G蛋白偶聯(lián)受體超家族的一員,其受體跨膜蛋白上可能存在機(jī)械應(yīng)力感受位點(diǎn),在機(jī)械牽張的過(guò)程中這些位點(diǎn)被活化,從而導(dǎo)致AT1-R構(gòu)象發(fā)生相應(yīng)改變而被激活。而且,通過(guò)這些位點(diǎn)活化的AT1-R,可能激活的是G蛋白非依賴(lài)的旁路途徑,并最終改變心肌細(xì)胞的生物學(xué)性狀。因?yàn)?在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞牽張實(shí)驗(yàn)中,我們確實(shí)篩選到一類(lèi)重要的信號(hào)支架蛋白——β-arrestin2有細(xì)胞膜招募的現(xiàn)象,同時(shí)在一些研究中證實(shí),β-arrestin蛋白依賴(lài)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在GPCRs受體活化中非常重要,可能參與了心臟重構(gòu)的過(guò)程。因此,本研究從AT1-R受體活化的感受位點(diǎn)著手,深入探究機(jī)械應(yīng)力激活A(yù)T1-R介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,以及在誘導(dǎo)心肌細(xì)胞生物性狀改變的分子機(jī)制。從而明確壓力超負(fù)荷引起的心室重構(gòu)以及心力衰竭的發(fā)病機(jī)理,為臨床預(yù)防和治療壓力負(fù)荷型心血管疾病提供理論依據(jù)和篩選藥物靶點(diǎn)。 第一部分：機(jī)械應(yīng)力致AT1-R構(gòu)象改變的作用位點(diǎn)和受體激活的分子機(jī)制 目的：探討機(jī)械應(yīng)力激活A(yù)T1-R受體的具體感受位點(diǎn)和以及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 方法：通過(guò)構(gòu)建的不同AT1-R膜蛋白結(jié)構(gòu)域(TM)的突變體與外源性FLAG標(biāo)記的ERK2共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞,經(jīng)機(jī)械牽張10分鐘后,觀測(cè)AT1-R活化介導(dǎo)的外轉(zhuǎn)的磷酸化ERK1/2水平變化。同時(shí),利用AngⅡ和機(jī)械牽張兩種激活A(yù)T1-R方式分別檢測(cè)受體活化介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路改變。并通過(guò)阻斷G蛋白偶聯(lián)途徑上的關(guān)鍵效應(yīng)分子：(1)GTP拮抗劑G0635或轉(zhuǎn)染Gaq負(fù)調(diào)控基因RGS4阻斷G蛋白活化；(2)利用GF109203X阻斷PKC分子分別觀察AngⅡ(10-7mol/L)干預(yù)和機(jī)械牽張(10%)對(duì)于下游ERK1/2活性的影響。 結(jié)果：野生型AT1-R在AngⅡ和機(jī)械牽張兩種刺激下都可活化ERK1/2；位于靠近AT1-R的N端TM1-3區(qū)域的突變(C76A、C121A)僅對(duì)機(jī)械牽張刺激有應(yīng)答；位于中部TM4～5區(qū)域的突變(C149A、K199Q)對(duì)于AT1-R的激活沒(méi)有影響,而K199Q轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞株對(duì)于AngⅡ的應(yīng)答明顯減弱；位于靠近C端TM6～7區(qū)域的突變(H256A、C289A)僅對(duì)AngⅡ刺激有應(yīng)答；位于C末端的突變(G303R)致機(jī)械牽張和AngⅡ的活化AT1-R的效應(yīng)皆消失。同時(shí),機(jī)械牽張介導(dǎo)的時(shí)間-依賴(lài)性PKC和IPx的表達(dá)明顯弱于AngⅡ的作用；并且阻斷了G蛋白偶聯(lián)機(jī)制(Gαq或PKC)后,AngⅡ激活A(yù)T1-R細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路被抑制；而對(duì)于機(jī)械牽張誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化效應(yīng)沒(méi)有影響。 結(jié)論：AT1-R對(duì)機(jī)械負(fù)荷刺激的感應(yīng)部位靠近受體C端的TM7結(jié)構(gòu)域,并通過(guò)C末端殘基調(diào)節(jié)機(jī)械-化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換；機(jī)械應(yīng)力激活A(yù)T1-R介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)不依賴(lài)G蛋白偶聯(lián),而是通過(guò)G蛋白非依賴(lài)的旁路途徑活化心肌細(xì)胞效應(yīng)分子ERK1/2。 第二部分：機(jī)械牽張活化AT1-R介導(dǎo)G蛋白非依賴(lài)信號(hào)通路的研究 目的：闡明機(jī)械應(yīng)力激活A(yù)T1-R的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白和活化ERK1/2的信號(hào)通路。 方法：通過(guò)細(xì)胞免疫熒光和免疫共沉淀技術(shù),在心肌細(xì)胞或轉(zhuǎn)染AT1-R受體的HEK-293細(xì)胞,檢測(cè)機(jī)械牽張后與AT1-R發(fā)生作用關(guān)系的信號(hào)支架蛋白的表達(dá)和定位,以及激活下游ERK1/2的信號(hào)機(jī)制。并且通過(guò)在體的ATG基因敲除小鼠(不表達(dá)血管緊張素原)驗(yàn)證該蛋白在壓力超負(fù)荷刺激下的作用機(jī)制；通過(guò)心臟超聲和血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)心臟形態(tài)和心臟功能,判斷阻斷該蛋白信號(hào)通路后對(duì)于心室重構(gòu)的影響。 結(jié)果：體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,機(jī)械牽張10分鐘后信號(hào)支架蛋白β-arrestin1/2的mRNA和蛋白水平皆沒(méi)有變化,而β-arrestin2有細(xì)胞膜招募的現(xiàn)象。單獨(dú)轉(zhuǎn)染β-arrestin1或β-arrestin2對(duì)于機(jī)械牽張的效應(yīng)不同,僅β-arrestin2可增強(qiáng)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)磷酸化ERK1/2的表達(dá)。同時(shí),伴隨β-arrestin2的細(xì)胞膜聚集,Src激酶的水平持續(xù)增高。免疫共沉淀顯示機(jī)械牽張可促進(jìn)Src與β-arrestin2的結(jié)合,并且免疫熒光顯示在突變?chǔ)?arrestin2的催化中心結(jié)構(gòu)域(V54D)后,有效阻斷β-arrestin2與Src的細(xì)胞膜上聚集。利用SU6656(Src激酶抑制劑)或者β-arrestin2siRNA同樣有效地抑制機(jī)械牽張引起的ERK1/2活化。體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,機(jī)械應(yīng)力(TAC模型)可增強(qiáng)ATG-/-小鼠心肌AT1-R的表達(dá),同時(shí)組織膜蛋白中的β-arrestin2的水平也顯著升高。心臟超聲顯示：在壓力超負(fù)荷(TAC)2周,ATG-/-小鼠與C57野生型小鼠一樣,心臟舒張期左心室前壁(LVAWd)和后壁(LVPWd)明顯增厚;左心室射血分?jǐn)?shù)代償性增加；同時(shí)血流動(dòng)力學(xué)顯示主動(dòng)脈血壓(ABP)和左心室收縮末期壓(LVESP)和左心室內(nèi)壓力變化速率(dp/dtmax)也相應(yīng)的升高。經(jīng)過(guò)SU6656預(yù)處理后,可有效逆轉(zhuǎn)TAC導(dǎo)致增高的心臟超聲和血流動(dòng)力學(xué)相關(guān)指標(biāo)。此外,通過(guò)SU6656抑制Src激酶后,誘導(dǎo)心肌肥厚的胎兒基因ANP、BNP、和SAA的mRNA水平也有明顯下調(diào),僅SERCA2a的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào),提示阻斷β-arrestin2/Src信號(hào)通路可以減弱壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)心肌肥厚的發(fā)生。 結(jié)論：β-arrestin2的細(xì)胞膜招募可有效激活Src激酶,并促進(jìn)效應(yīng)分子ERK1/2的磷酸化水平增高,是機(jī)械牽張活化AT1-R受體的關(guān)鍵信號(hào)機(jī)制。同時(shí),血管緊張素非依賴(lài)的ATl-R活化同樣可誘導(dǎo)心室重構(gòu)的發(fā)生,通過(guò)阻斷β-arrestin2/Src信號(hào)通路可改善心室重構(gòu)現(xiàn)象。 第三部分：機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)細(xì)胞膜招募β-arrestin2與AT1-R的結(jié)合部位 目的：驗(yàn)證AT1-R的TM7結(jié)構(gòu)域?qū)?xì)胞膜招募β-arrestin2及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要性。 方法：在COS7細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染FLAG-β-arrestin2質(zhì)粒和TM7結(jié)構(gòu)域(或C末端突變)的AT1受體質(zhì)粒Cys289Ala和Gly303Arg,通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)TM7-C末端區(qū)域突變對(duì)于AT1與β-arrestin2結(jié)合的影響；選用機(jī)械牽張敏感的特異性的ARBs(坎地沙坦)抑制AT1-R的激活后,測(cè)定ERK1/2磷酸化水平并與機(jī)械牽張不敏感而AngⅡ敏感的ARBs(替米沙坦)的效應(yīng)比較；利用Westernblot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染Cys289Ala和Gly303Arg突變體質(zhì)粒的COS7細(xì)胞的凋亡相關(guān)指標(biāo)：Caspase3的活性以及Bcl-2與Bax的比例,觀察阻斷AT1-R的TM7～C末端的壓力感應(yīng)和信號(hào)傳遞部位后對(duì)于細(xì)胞生存的影響。 結(jié)果：機(jī)械牽張后細(xì)胞膜蛋白中檢測(cè)到AT1與β-arrestin2的結(jié)合在Cys289Ala和Gly303Arg轉(zhuǎn)染細(xì)胞株明顯減少；同時(shí),利用坎地沙坦抑制TM7區(qū)域的構(gòu)象改變后有效阻斷了機(jī)械牽張引起的ERK1/2活化；而且在Cys289Ala和Gly303Arg轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞,機(jī)械牽張引起的細(xì)胞凋亡明顯增多,表現(xiàn)為Caspase3活性升高和Bcl-2/Bax比例下降。 結(jié)論：TM7結(jié)構(gòu)域的變構(gòu)是機(jī)械應(yīng)力激活A(yù)T1-R致機(jī)械-生物信號(hào)轉(zhuǎn)換的重要特征,對(duì)于β-arrestin2的膜上招募和下游信號(hào)ERK1/2活化非常重要。突變或抑制這一部位的運(yùn)動(dòng)阻斷了β-arrestin2信號(hào),而激活了細(xì)胞的凋亡信號(hào)。 第四部分：AT1-R介導(dǎo)的β-arrestin2信號(hào)在心肌纖維化中作用 目的：研究機(jī)械應(yīng)力激活β-arrestin2信號(hào)通路對(duì)壓力超負(fù)荷下心肌纖維化的影響。 方法：首先,在不表達(dá)AT1-R和高表達(dá)AT1-R的兩種293細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染FLAG-β-arrestin2質(zhì)粒,利用Westernblot技術(shù)檢測(cè)機(jī)械牽張刺激兩種細(xì)胞后TGF-β1信號(hào)效應(yīng)蛋白Cofilin和LIMK的表達(dá)；其次,轉(zhuǎn)染β-arrestin2突變體和使用SU6656預(yù)處理觀察Src激酶對(duì)于β-arrestin2調(diào)控Cofilin/LIMK的作用；第三,通過(guò)沉默Cofilin基因檢測(cè)β-arrestin2激活Cofilin對(duì)于TGF-β1信號(hào)分子(TGF-PRI、ROCK和Smad3)的調(diào)控作用。在體內(nèi)利用慢病毒轉(zhuǎn)染β-arrestin2shRNA敲減ATG-/-小鼠體內(nèi)β-arrestin2的表達(dá)后,檢測(cè)壓力超負(fù)荷刺激下心肌纖維化的各項(xiàng)指標(biāo)變化：MassonⅢ染色法測(cè)定心室肌的膠原表達(dá)量；RT-PCR測(cè)定Ⅰ型和Ⅲ型膠原的mRNA水平；Westernblot測(cè)定ROCK和Cofilin蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：β-arrestin2通過(guò)AT1-R激活依賴(lài)的方式調(diào)控Cofilin/LIMK的活性,卻不依賴(lài)于Src激酶的活化；抑制Cofilin蛋白可阻斷β-arrestin2對(duì)于機(jī)械應(yīng)力激活TGF-β1信號(hào)的調(diào)控作用；在ATG-/-小鼠體內(nèi)敲減β-arrestin2的水平可明顯抑制壓力超負(fù)荷下TGF-β1的信號(hào),減緩心室肌膠原的表達(dá)和促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生。 結(jié)論：機(jī)械應(yīng)力激活的AT1-R/β-arrestin2信號(hào)通路可誘導(dǎo)心肌肥厚的同時(shí)通過(guò)調(diào)控Cofilin/LIMK的活性來(lái)加速心肌纖維化的進(jìn)程；抑制β-arrestin2對(duì)于壓力超負(fù)荷介導(dǎo)ATG-/-小鼠心室重構(gòu)具有心臟保護(hù)效應(yīng)。 總結(jié)： 1.不同于Angll激活A(yù)T1-R受體是通過(guò)G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)機(jī)制活化效應(yīng)分子ERK1/2,機(jī)械牽張激活A(yù)T1-R受體是經(jīng)G蛋白非依賴(lài)的β-arrestin2信號(hào)通路促進(jìn)下游ERK1/2磷酸化。 2.AT1-R的TM7結(jié)構(gòu)域是機(jī)械牽張活化受體的壓力感受位點(diǎn)和機(jī)械-化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵部位。 3.AT1-R介導(dǎo)的β-arrestin2/Src信號(hào)途徑促進(jìn)壓力超負(fù)荷下心肌肥厚的發(fā)生。 4. β-arrestin2以AT1-R激活依賴(lài)的方式調(diào)控Cofilin/LIMK蛋白活性,促進(jìn)壓力超負(fù)荷下心肌纖維化的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1650105