本文選題：原代分離　切入點：肺泡上皮細(xì)胞　出處：《蘭州大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的建立原代大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(AECⅡ)的分離、純化及原代培養(yǎng)的方法,探索丙烯醛對AECⅡ細(xì)胞周期的影響,同時觀察維生素A酸(RA)能否拮抗丙烯醛對AECⅡ的損傷作用。方法用4.2u/ml的彈性蛋白酶溶液通過氣管插管注入肺泡內(nèi),消化分離AECⅡ。把細(xì)胞懸液接種到包被有大鼠IgG的塑料平皿中純化細(xì)胞。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況,用電鏡、堿性磷酸酶顯色法(BCIP/NBT)、改良巴氏染色法、單寧酸染色法、免疫組化染色法鑒定AECⅡ并計算細(xì)胞純度。用MTT法檢測丙烯醛對AECⅡ活力的影響,流式細(xì)胞儀檢測在丙烯醛及RA作用下AECⅡ細(xì)胞周期的變化。運用反轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技術(shù)檢測P21、P53在mRNA水平的變化。結(jié)果分離所得AECⅡ純度達(dá)到90%以上,倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈島嶼狀生長,胞漿內(nèi)可見大量黑色顆粒。電鏡下可見細(xì)胞內(nèi)有大量板層小體,其中有些板層小體呈空泡狀結(jié)構(gòu),細(xì)胞膜上有絨毛裝結(jié)構(gòu)。BCIP/NBT染色可見胞漿內(nèi)有藍(lán)色顆粒。改良巴氏染色法、單寧酸染色法可見胞漿內(nèi)有黑色顆粒�？勾笫蠓闻荼砻婊钚晕镔|(zhì)A(SP-A)免疫組化染色呈陽性反應(yīng)。在丙烯醛作用下,AECⅡ細(xì)胞生長明顯受到抑制,流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,丙烯醛作用下細(xì)胞周期被阻滯在G1期,RA對丙烯醛的拮抗作用不明顯。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,和對照組相比,丙烯醛作用后P21mRNA表達(dá)在其他各組均明顯下調(diào),且各干預(yù)組之間P21mRNA表達(dá)沒有明顯差異；P53基因表達(dá)在對照組和各干預(yù)組之間沒有明顯差異。結(jié)論彈性蛋白酶作用溫和,不損傷細(xì)胞膜,分離所得AECⅡ細(xì)胞活力好、純度高。IgG免疫粘附純化法操作簡單,特異性高,純化效率較高。電鏡、堿性磷酸酶染色(BCIP/NBT)、巴氏染色、單寧酸染色及免疫組化顯色等鑒定方法穩(wěn)定可靠,特異性高。在丙烯醛對AECⅡ細(xì)胞周期的影響中,丙烯醛導(dǎo)致AECⅡ生長受抑制,RA對丙烯醛的拮抗作用微弱。P21基因的表達(dá)在丙烯醛刺激下明顯下調(diào),而未見RA對此具有拮抗作用,P53基因的表達(dá)在丙烯醛或／和RA的作用下均未受到明顯的影響。
[Abstract]:Objective to establish a method for the isolation, purification and primary culture of primary rat alveolar type 鈪，

本文編號：1646161