發(fā)布時間：2018-03-20 15:24

  本文選題：氯胺酮　切入點：海馬　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分新生大鼠海馬神經(jīng)元原代無血清培養(yǎng)、鑒定與形態(tài)觀察 目的：建立一種簡單、易行的海馬神經(jīng)元無血清體外培養(yǎng)方法以獲得高純度、高活力的海馬神經(jīng)元；觀察原代海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)特點，測定細(xì)胞生長曲線。 方法：取新生24h內(nèi)SD乳鼠，斷頭取腦，于預(yù)冷D-hanks玻璃皿中，剝離兩側(cè)海馬，機械分離，移入離心管，離心棄上清，加入Accutase酶消化10~20min，含10%FBS的DMEM洗滌、終止消化，經(jīng)200目銅濾網(wǎng)過濾。離心棄上清，加入含10%FBS的DMEM液，吹打成細(xì)胞懸液。轉(zhuǎn)至塑料培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱經(jīng)差速貼壁1h，收獲貼壁速度較膠質(zhì)細(xì)胞慢的神經(jīng)元，吹打后以0.4%臺盼藍染色計數(shù)活細(xì)胞并調(diào)整懸液的細(xì)胞密度，按1×106/mL的濃度將細(xì)胞種植在Matrigel基膜包被后的蓋玻片上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。24h內(nèi)全量換含有N2、B27的Neurobasal培養(yǎng)液，其后，每兩天半量換液，并在倒置相差顯微鏡下觀察神經(jīng)元生長情況。取培養(yǎng)7d神經(jīng)元，采用β-tublinⅢ免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)鑒定海馬神經(jīng)元純度。采用MTT法，每隔兩天測吸光度值，繪出生長曲線。 結(jié)果：1剛接種的海馬神經(jīng)元呈圓形，體積小、透亮、呈懸浮狀態(tài)，培養(yǎng)3h后開始貼壁，接種20h后可見大部分細(xì)胞已貼壁，細(xì)胞形態(tài)多呈梭形、三角形，長出細(xì)長突起，長短不一。3d后胞體飽滿，多呈梭形，胞漿豐富，細(xì)胞聚集成團，突起較前明顯增長、增粗，連接成網(wǎng)絡(luò)。7~10d神經(jīng)元胞體最豐滿，周圍光暈明顯，突起交織成更加稠密的網(wǎng)絡(luò)，突起增粗增長且光暈明顯，立體感增強。20d后神經(jīng)細(xì)胞開始退化，細(xì)胞邊緣光暈變淡，突起開始退縮，部分細(xì)胞核固縮明顯。2原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，經(jīng)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物β-tublinШ單克隆抗體和Hoechst33258熒光染色后在熒光倒置顯微鏡下鑒定，計算海馬神經(jīng)元純度為94.2%±3.6%，能夠滿足進一步的實驗要求。3原代海馬神經(jīng)元生長曲線測定顯示，海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)條件下經(jīng)歷了生長潛伏期(2~4d)，對數(shù)生長期(4~14d)，后進入生長平臺期(14~16d)，細(xì)胞生長處于停滯狀態(tài)。 結(jié)論：1原代SD乳鼠海馬神經(jīng)元，培養(yǎng)10d后細(xì)胞形態(tài)趨于成熟。相差顯微鏡下形態(tài)呈錐體形、梭形、三角形。2原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色為β-tublinШ陽性細(xì)胞，純度為94.2%±3.6%。3原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)經(jīng)歷生長潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期。 第二部分氯胺酮對發(fā)育期海馬神經(jīng)元活力和凋亡的影響 目的：不同濃度的氯胺酮培養(yǎng)不同時間，采用MTT法測定氯胺酮對發(fā)育期海馬神經(jīng)元活性的影響；采用流式細(xì)胞技術(shù)測定不同濃度氯胺酮培養(yǎng)12h對神經(jīng)元凋亡率和細(xì)胞周期的影響，，Hoechst33258熒光染色細(xì)胞核觀察凋亡情況。 方法：取原代培養(yǎng)4-5d海馬神經(jīng)元，加入0.1uM、1uM、100uM、300uM、1mM不同濃度氯胺酮，分別作用3、6、12、24h后，測量MTT值。每次實驗設(shè)空白對照組，即原代培養(yǎng)基。細(xì)胞活力=(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)。根據(jù)MTT結(jié)果，取原代培養(yǎng)4-5d海馬神經(jīng)元，在6孔板培養(yǎng)體系中加入不同濃度氯胺酮，繼續(xù)培養(yǎng)12h，制備標(biāo)本，上流式細(xì)胞儀檢測凋亡和細(xì)胞周期；Hoechst33258熒光染色細(xì)胞核驗證流式結(jié)果，前期培養(yǎng)及分組同流式檢測各組。 結(jié)果：1氯胺酮對海馬神經(jīng)元活力的抑制具有時間和濃度的交互作用(F=6.227， P0.01)。在不同作用時間下，氯胺酮對神經(jīng)元活力的影響具有顯著差異(F=6.750，P0.01),其中300uM和1mM氯胺酮在處理不同時間后差異具有顯著性(F=4.192， P0.05和F=44.444，P0.01)，余各濃度處理不同時間后無顯著性差異。當(dāng)作用時間相同時，不同濃度的氯胺酮對海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響具有顯著性差異（F=136.068，P0.01),與對照組相比300uM和1mM氯胺酮在各個作用時間上均具有顯著性差異，以1mM處理24h對海馬神經(jīng)元活力下降最明顯，達60%。0.1和1uM氯胺酮分別在24h和12h增加了海馬神經(jīng)元活力(P0.05)。2流式細(xì)胞儀檢測凋亡率顯示，各濃度氯胺酮處理12h對海馬神經(jīng)元凋亡率的影響具有顯著差異（F=80.507，P0.01），各濃度氯胺酮同對照組比較，100、300和1000uM濃度有統(tǒng)計學(xué)差異，且凋亡率隨濃度的增加而增加。細(xì)胞周期的檢測結(jié)果顯示，各濃度氯胺酮處理12h對海馬神經(jīng)元細(xì)胞周期的G0/G1、S和增殖率的影響具有顯著差異（F=109.192, P0.01、F=57.342, P0.01和F=108.726，P0.01），10、100、300和1000uM濃度有統(tǒng)計學(xué)差異，隨濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比率逐漸下降，S期細(xì)胞比率和PI逐漸增高，但G_2/M期細(xì)胞比率在所有組別中未見統(tǒng)計學(xué)差異（F=2.463，P=0.077）。3Hoechst33258熒光染色顯示隨氯胺酮濃度的增加，呈波紋狀或呈折縫樣的細(xì)胞核逐漸增多，部分染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，1000uM時細(xì)胞核甚至裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。 結(jié)論：氯胺酮對海馬神經(jīng)元活力的抑制具有濃度及時間依賴性，隨著濃度的增加及作用時間延長，氯胺酮對神經(jīng)元毒性作用逐漸增強，以1mM最明顯。高濃度（100~1000uM）氯胺酮引起發(fā)育期海馬神經(jīng)元凋亡率的增加。氯胺酮可促進海馬神經(jīng)元由G_0/G_1期進入S期，但不能進入G2/M期，細(xì)胞增殖阻滯于S期。 第三部分氯胺酮對發(fā)育期海馬神經(jīng)元鈣震蕩的影響 目的：以離體發(fā)育期海馬神經(jīng)元為研究對象，探討氯胺酮對發(fā)育期海馬神經(jīng)元胞內(nèi)自發(fā)鈣振蕩的影響與機制。 方法：取培養(yǎng)4-5d的海馬神經(jīng)元，用Krebs-Ringer液清洗三次，F(xiàn)luo-4AM工作液37oC孵育30min。再用Krebs-Ringer液清洗三次、孵育15分鐘以去除細(xì)胞表面的非特異性染色。將孵育有Fluo-4AM細(xì)胞爬片置于激光共聚焦顯微鏡特制的灌流槽中，共聚焦顯微鏡下調(diào)焦平面，使海馬神經(jīng)元能清晰顯示，用氬離子激光器激發(fā)熒光，在激光掃描共聚焦顯微鏡下對細(xì)胞XYT平面進行掃描，掃描頻率為1次/s，采用連續(xù)掃描的方式記錄熒光變化。首先用Neurobasal培養(yǎng)基或含預(yù)處理藥物的Neurobasal培養(yǎng)基灌流2min作為藥物干預(yù)前的對照，再換用含有干預(yù)藥物的Neurobasal培養(yǎng)基（預(yù)處理藥物和干預(yù)藥物均以需要的終濃度預(yù)先溶解在Neurobasal培養(yǎng)基中），待藥物作用1min后，觀測藥物對神經(jīng)元鈣振蕩振幅和頻率的影響，時間同樣為2min。用半定量測試法來定量分析神經(jīng)元鈣振蕩的鈣峰，即以胞漿內(nèi)鈣熒光（Fluo-4AM）的熒光值的變化來（F/F_0）表示胞漿內(nèi)的鈣濃度改變。其中F表示某一時點t時胞漿的鈣熒光值，而F_0則代表t時點正負(fù)10秒內(nèi)胞漿最低熒光值的算術(shù)平均值，以F/F_0㧐1.2定義為一次鈣震蕩的發(fā)生。研究藥物包括：氯胺酮、NMDA和MK801。 結(jié)果：1隨機選取海馬神經(jīng)元觀察，呈現(xiàn)出典型的鈣振蕩。這些神經(jīng)元鈣振蕩頻率為0.042±0.006Hz，振幅（F/F_0）為2.01±0.07。2100μMNMDA干預(yù)可使神經(jīng)元鈣振蕩的振幅增強，振幅（F/F_0）變化有明顯的統(tǒng)計差異（P0.01），而振蕩頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。40μM MK-801可使海馬神經(jīng)元鈣振蕩的振幅（F/F_0）和頻率明顯降低，有明顯的統(tǒng)計差異（P0.01）。3在1-10uM范圍內(nèi)，氯胺酮對發(fā)育期海馬神經(jīng)元鈣振蕩的頻率和振幅無明顯影響。從30uM開始，隨著氯胺酮濃度的增加神經(jīng)元鈣振蕩的振幅逐漸減小，但30-100uM的氯胺酮對鈣振蕩頻率雖有所抑制但無統(tǒng)計學(xué)意義，從300uM開始，氯胺酮對鈣振蕩頻率的抑制有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。3000uM的氯胺酮可使神經(jīng)元鈣振蕩完全消失。4分別用100、300、1000uM的NMDA作用于已被1M氯胺酮作用的海馬神經(jīng)元。鈣震蕩的頻率和振幅隨著NMDA濃度的增加而逐漸逆轉(zhuǎn)，當(dāng)NMDA達到1000uM時，鈣震蕩的頻率和振幅被完全逆轉(zhuǎn)。 結(jié)論：1發(fā)育期海馬神經(jīng)元在激光共聚焦顯微鏡下呈現(xiàn)出典型的鈣振蕩。2氯胺酮能夠呈劑量依賴性的抑制發(fā)育期海馬神經(jīng)元的鈣震蕩，3000uM時，鈣震蕩完全消失。3NMDA能夠逆轉(zhuǎn)氯胺酮對神經(jīng)元鈣震蕩的抑制。 第四部分PKCγ-ERK信號通路在氯胺酮致發(fā)育期海馬神經(jīng)元毒性中的作用 目的：通過流式細(xì)胞術(shù)觀察NMDA對氯胺酮神經(jīng)毒性的影響，采用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western技術(shù)檢測PKCγ-ERK信號通路在氯胺酮神經(jīng)毒性中的作用及應(yīng)用NMDA后的變化。 方法：取原代培養(yǎng)4-5d海馬神經(jīng)元進行實驗，分為對照組、300uM氯胺酮處理組、300uM氯胺酮加100uMNMDA混合組、100uM NMDA組，即C組、K組、K+N組和N組，培養(yǎng)時間為12h。采用AnxexinV/PI雙染法上流式細(xì)胞儀檢測實驗各組海馬神經(jīng)元早期和晚期凋亡率。利用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot分析各實驗組pPKCγ、tPKCγ、pERK1/2、tERK1/2和Bcl-2表達的改變。 結(jié)果：1K組海馬神經(jīng)元無論早期還是晚期凋亡率比C組明顯增高（P0.01，P0.01），K+N組與K組相比早期和晚期凋亡率明顯降低（P0.01，P0.01），K+N組與C組相比早期和晚期凋亡率仍高（P0.01，P0.05）。2免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示：K組與C組相比pPKCγ、tPKCγ、pERK1/2、tERK1/2和Bcl-2表達明顯降低（P0.01），K+N組與K組相比pPKCγ、pERK1/2、tERK1/2和Bcl-2表達明顯升高（P0.01），tPKCγ增高（P0.05），K+N組與C組相比pPKCγ、tPKCγ、pERK1/2、tERK1/2和Bcl-2表達明顯降低（P0.01）。3Western blot分析顯示：K組與C組相比pPKCγ、tPKCγ、pERK1/2、tERK1/2和Bcl-2表達明顯降低（P0.01）；K+N組與K組相比pPKCγ、pERK1/2、tERK1/2和Bcl-2表達明顯升高（P0.01），tPKCγ增高（P0.05）；K+N組與C組相比pPKCγ和pERK1/2表達明顯降低（P0.01），tPKCγ（P0.05），tERK1/2和Bcl-2表達變化無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：1.300uM氯胺酮培養(yǎng)12h可導(dǎo)致發(fā)育期海馬神經(jīng)元凋亡增加，使用100uMNMDA可以減輕氯胺酮的毒性作用。2.氯胺酮能夠明顯抑制PKC γ-ERK信號通路，PKC γ-ERK信號通路的抑制參與了氯胺酮的毒性機制。 第五部分氯胺酮對發(fā)育期SD幼鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能的影響 目的：選擇不同劑量氯胺酮對7日齡幼鼠進行連續(xù)三天的腹腔注射，觀察其對大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及成年后大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的受損情況。 方法：七日齡SD幼鼠76只，隨機分四組，每組19只， K_1、 K_2、K_3組分別腹腔注射氯胺酮25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg，C組（對照組）腹腔注射等容量生理鹽水，腹腔注射連續(xù)三天每天一次，麻醉后把幼鼠放在暖箱中并保持低流量給氧,密切觀察乳鼠的皮膚顏色，有無缺氧表現(xiàn),各劑量組SD幼鼠在注藥完畢后與母鼠分離時間均為250min。實驗各組隨機取5只幼鼠，采用TUNEL法檢測海馬CA1、CA2、CA3和齒狀回神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。各組余14只飼養(yǎng)至60天進行水迷宮實驗，檢測成年后大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的受損情況。 結(jié)果：1K3組同對照組比較，海馬CA1區(qū)和齒狀回神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加，具有顯著差異（P0.01，P0.01）。2在5天的訓(xùn)練期中，前3天實驗各組逃逸潛伏期和距離差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在第4天和第5天，K_3組相比對照組的逃逸潛伏期和游泳距離長，有統(tǒng)計學(xué)差異。在第6天的空間探索試驗中，與對照組相比K_2和K_3組逃逸潛伏期長，有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05，P0.01）。K_3組相比對照組穿越平臺的次數(shù)和在靶象限的時間比率少于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05，P0.01）。 結(jié)論：連續(xù)三天給予7日齡SD幼鼠腹腔注射氯胺酮可導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡增加，成年后學(xué)習(xí)記憶能力的損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R338

【參考文獻】

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本文編號：1639671