本文選題：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激　切入點：自噬　出處：《吉林大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：不同的病理條件如果擾亂了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，影響蛋白折疊，即會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生。細胞通過活化未折疊蛋白反應和蛋白降解途徑如自噬，適應內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。雖然內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通常被視作為一種代償反應，但是當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯誤折疊蛋白負荷過重時，細胞就會死亡，特別是凋亡性死亡。近來研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激也能誘發(fā)自噬性細胞死亡。這表明在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激嚴重程度不同時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其后續(xù)活化的自噬可發(fā)揮促細胞存活/死亡的雙重作用。已有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯誤折疊蛋白可誘導生成ROS。微量的活性氧，作為信號分子可以在細胞的一些生理過程中發(fā)揮重要的作用，而胞內(nèi)活性氧水平的顯著增高則可快速觸發(fā)細胞凋亡。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以通過激活MAPK信號途徑從而誘發(fā)自噬。在不同程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激條件下，MAPK信號途徑的活化水平及其對胞內(nèi)生成的ROS水平的影響有無改變；ROS對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激觸發(fā)的自噬的調(diào)控作用有無改變，目前尚未有報道。這些轉變是否可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激觸發(fā)的自噬對細胞存活產(chǎn)生不同影響的前期指標，尚且有待進一步的研究來驗證。 目的： 探討在不同程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激條件下，，細胞中活性氧ROS對自噬及凋亡的調(diào)控作用。 方法： 利用不同濃度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑DTT刺激人宮頸癌Hela細胞復制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型。蛋白免疫印跡實驗Western Blot方法檢測細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白GRP78、p-PERK，自噬相關蛋白LC3，MAPK信號途徑相關蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38MAPK，以及凋亡相關蛋白caspase3及其裂解片段的表達水平。DCFH-DA探針檢測細胞內(nèi)的ROS水平。不同的藥物如自噬抑制劑3-MA、活性氧清除劑NAC以及MAPK途徑相關抑制劑SB203580、SP600125及UO126等，與DTT合用作用細胞，采用MTT法分別檢測自噬、活性氧及MAPK相關信號途徑對細胞存活率的影響。流式細胞術檢測細胞凋亡率，免疫熒光檢測自噬相關蛋白LC3、p62及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白PDI的表達水平。JC-1試劑盒檢測細胞的線粒體膜電勢。 結果： （1）Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，小劑量DTT作用Hela細胞，可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白GRP78、p-PERK表達上調(diào)，PDI熒光強度略微增強，細胞發(fā)生了輕度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；同時自噬相關蛋白LC3II表達明顯增加，凋亡相關蛋白caspase3裂解片段的表達略微上調(diào)，預示著自噬及凋亡被誘導激活。MAPK信號途徑相關蛋白p-JNK、p-p38的表達輕度上調(diào)，p-ERK的表達顯著增強。而Hela細胞在大劑量DTT作用下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白GRP78、p-PERK的表達進一步上調(diào)，PDI熒光強度顯著增強，細胞發(fā)生了較重度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；同時自噬相關蛋白LC3II表達明顯增加，凋亡相關蛋白caspase3裂解片段的表達明顯上調(diào)，預示著自噬及凋亡的活化水平隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激程度的加重有所增強。MAPK信號途徑相關蛋白p-JNK、p-p38的表達明顯上調(diào)，p-ERK的表達顯著減弱。 （2）MTT檢測發(fā)現(xiàn)，小劑量DTT合用自噬抑制劑3-MA、抗氧化劑NAC，或ERK抑制劑U0126時，細胞存活率都下降，而合用JNK抑制劑SP600125、p38抑制劑SB203580時，細胞存活率增加。這表明自噬、ROS及ERK在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激程度較輕時，主要發(fā)揮維持細胞存活的作用，而JNK、p38MAPK信號通路主要發(fā)揮促細胞死亡的作用。大劑量DTT合用自噬抑制劑3-MA或抗氧化劑NAC，合用JNK抑制劑SP600125、ERK抑制劑U0126或p38MAPK抑制劑SB203580時，細胞存活率都增加。這表明自噬、ROS及MAPK信號通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激程度較重時，主要發(fā)揮了促細胞死亡的作用。 （3）DCFH-DA探針檢測發(fā)現(xiàn)，DTT大小劑量組中胞內(nèi)的ROS水平都有上升。小劑量DTT合用抗氧化劑NAC后，Annexin-v/PI流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)凋亡率增加，免疫熒光結果顯示LC3同p62的共定位水平下降，細胞自噬的活化水平下降。這表明在輕度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激條件下，ROS主要發(fā)揮了促進自噬活化及抑制凋亡的作用。與之相反，大劑量DTT與抗氧化劑NAC合用后， Annexin-v/PI流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)凋亡率下降，免疫熒光結果顯示LC3同p62的共定位水平增強，細胞自噬的活化水平增強。這表明在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激程度較重時，ROS主要發(fā)揮了抑制自噬活化及促進凋亡的作用。 （4）合用p38MAPK抑制劑SB203580后，小劑量DTT中胞內(nèi)ROS水平明顯增加，而大劑量組中胞內(nèi)ROS水平下降。這表明p38MAPK信號通路可能參與調(diào)控胞內(nèi)ROS水平。JC-1試劑盒檢測線粒體膜電勢發(fā)現(xiàn)，大小劑量DTT處理細胞均可誘導線粒體膜電勢顯著下降。合用p38抑制劑SB203580后，DTT大劑量組中線粒體膜電勢回升，DTT小劑量組中線粒體膜電勢無明顯改變。這表明p38MAPK在重度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過程中，可能通過調(diào)節(jié)線粒體膜電勢，參與調(diào)控胞內(nèi)的ROS的水平，從而影響細胞的存活；而在輕度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過程中上述變化不明顯，可能是由其它的信號通路參與調(diào)控。 結論： （1）利用DTT成功復制了不同程度的人宮頸癌Hela細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型，細胞自噬及凋亡途徑被激活。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激程度較輕時，自噬發(fā)揮維持細胞存活的作用；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)程度較重時，自噬發(fā)揮促細胞死亡的作用。 （2）在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激程度較輕時，ROS促進自噬的活化并抑制凋亡，表現(xiàn)出維持細胞存活的作用；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)程度較重時，ROS抑制自噬的活化并促進凋亡，表現(xiàn)出促細胞死亡的作用。 （3）JNK、p38MAPK信號通路均發(fā)揮促進細胞死亡的作用，而ERK信號主要介導細胞的生存過程。在重度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過程中，p38MAPK可能通過調(diào)節(jié)線粒體膜電勢，參與調(diào)控胞內(nèi)ROS的水平，從而影響細胞的存活；而在輕度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過程中上述變化不明顯，可能由其它的信號通路參與調(diào)控ROS的水平。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363.1

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本文編號：1637747