本文選題：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激　切入點(diǎn)：自噬　出處：《吉林大學(xué)》2012年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：不同的病理?xiàng)l件如果擾亂了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，影響蛋白折疊，即會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。細(xì)胞通過(guò)活化未折疊蛋白反應(yīng)和蛋白降解途徑如自噬，適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。雖然內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通常被視作為一種代償反應(yīng)，但是當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯(cuò)誤折疊蛋白負(fù)荷過(guò)重時(shí)，細(xì)胞就會(huì)死亡，特別是凋亡性死亡。近來(lái)研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也能誘發(fā)自噬性細(xì)胞死亡。這表明在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激嚴(yán)重程度不同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其后續(xù)活化的自噬可發(fā)揮促細(xì)胞存活/死亡的雙重作用。已有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯(cuò)誤折疊蛋白可誘導(dǎo)生成ROS。微量的活性氧，作為信號(hào)分子可以在細(xì)胞的一些生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，而胞內(nèi)活性氧水平的顯著增高則可快速觸發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過(guò)激活MAPK信號(hào)途徑從而誘發(fā)自噬。在不同程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，MAPK信號(hào)途徑的活化水平及其對(duì)胞內(nèi)生成的ROS水平的影響有無(wú)改變；ROS對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)的自噬的調(diào)控作用有無(wú)改變，目前尚未有報(bào)道。這些轉(zhuǎn)變是否可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)的自噬對(duì)細(xì)胞存活產(chǎn)生不同影響的前期指標(biāo)，尚且有待進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證。 目的： 探討在不同程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，，細(xì)胞中活性氧ROS對(duì)自噬及凋亡的調(diào)控作用。 方法： 利用不同濃度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑DTT刺激人宮頸癌Hela細(xì)胞復(fù)制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、p-PERK，自噬相關(guān)蛋白LC3，MAPK信號(hào)途徑相關(guān)蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38MAPK，以及凋亡相關(guān)蛋白caspase3及其裂解片段的表達(dá)水平。DCFH-DA探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。不同的藥物如自噬抑制劑3-MA、活性氧清除劑NAC以及MAPK途徑相關(guān)抑制劑SB203580、SP600125及UO126等，與DTT合用作用細(xì)胞，采用MTT法分別檢測(cè)自噬、活性氧及MAPK相關(guān)信號(hào)途徑對(duì)細(xì)胞存活率的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，免疫熒光檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、p62及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白PDI的表達(dá)水平。JC-1試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電勢(shì)。 結(jié)果： （1）Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小劑量DTT作用Hela細(xì)胞，可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、p-PERK表達(dá)上調(diào)，PDI熒光強(qiáng)度略微增強(qiáng)，細(xì)胞發(fā)生了輕度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；同時(shí)自噬相關(guān)蛋白LC3II表達(dá)明顯增加，凋亡相關(guān)蛋白caspase3裂解片段的表達(dá)略微上調(diào)，預(yù)示著自噬及凋亡被誘導(dǎo)激活。MAPK信號(hào)途徑相關(guān)蛋白p-JNK、p-p38的表達(dá)輕度上調(diào)，p-ERK的表達(dá)顯著增強(qiáng)。而Hela細(xì)胞在大劑量DTT作用下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、p-PERK的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，PDI熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，細(xì)胞發(fā)生了較重度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；同時(shí)自噬相關(guān)蛋白LC3II表達(dá)明顯增加，凋亡相關(guān)蛋白caspase3裂解片段的表達(dá)明顯上調(diào)，預(yù)示著自噬及凋亡的活化水平隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度的加重有所增強(qiáng)。MAPK信號(hào)途徑相關(guān)蛋白p-JNK、p-p38的表達(dá)明顯上調(diào)，p-ERK的表達(dá)顯著減弱。 （2）MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小劑量DTT合用自噬抑制劑3-MA、抗氧化劑NAC，或ERK抑制劑U0126時(shí)，細(xì)胞存活率都下降，而合用JNK抑制劑SP600125、p38抑制劑SB203580時(shí)，細(xì)胞存活率增加。這表明自噬、ROS及ERK在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度較輕時(shí)，主要發(fā)揮維持細(xì)胞存活的作用，而JNK、p38MAPK信號(hào)通路主要發(fā)揮促細(xì)胞死亡的作用。大劑量DTT合用自噬抑制劑3-MA或抗氧化劑NAC，合用JNK抑制劑SP600125、ERK抑制劑U0126或p38MAPK抑制劑SB203580時(shí)，細(xì)胞存活率都增加。這表明自噬、ROS及MAPK信號(hào)通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度較重時(shí)，主要發(fā)揮了促細(xì)胞死亡的作用。 （3）DCFH-DA探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DTT大小劑量組中胞內(nèi)的ROS水平都有上升。小劑量DTT合用抗氧化劑NAC后，Annexin-v/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)凋亡率增加，免疫熒光結(jié)果顯示LC3同p62的共定位水平下降，細(xì)胞自噬的活化水平下降。這表明在輕度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，ROS主要發(fā)揮了促進(jìn)自噬活化及抑制凋亡的作用。與之相反，大劑量DTT與抗氧化劑NAC合用后， Annexin-v/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)凋亡率下降，免疫熒光結(jié)果顯示LC3同p62的共定位水平增強(qiáng)，細(xì)胞自噬的活化水平增強(qiáng)。這表明在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度較重時(shí)，ROS主要發(fā)揮了抑制自噬活化及促進(jìn)凋亡的作用。 （4）合用p38MAPK抑制劑SB203580后，小劑量DTT中胞內(nèi)ROS水平明顯增加，而大劑量組中胞內(nèi)ROS水平下降。這表明p38MAPK信號(hào)通路可能參與調(diào)控胞內(nèi)ROS水平。JC-1試劑盒檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電勢(shì)發(fā)現(xiàn)，大小劑量DTT處理細(xì)胞均可誘導(dǎo)線(xiàn)粒體膜電勢(shì)顯著下降。合用p38抑制劑SB203580后，DTT大劑量組中線(xiàn)粒體膜電勢(shì)回升，DTT小劑量組中線(xiàn)粒體膜電勢(shì)無(wú)明顯改變。這表明p38MAPK在重度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程中，可能通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體膜電勢(shì)，參與調(diào)控胞內(nèi)的ROS的水平，從而影響細(xì)胞的存活；而在輕度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程中上述變化不明顯，可能是由其它的信號(hào)通路參與調(diào)控。 結(jié)論： （1）利用DTT成功復(fù)制了不同程度的人宮頸癌Hela細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，細(xì)胞自噬及凋亡途徑被激活。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度較輕時(shí)，自噬發(fā)揮維持細(xì)胞存活的作用；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)程度較重時(shí)，自噬發(fā)揮促細(xì)胞死亡的作用。 （2）在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度較輕時(shí)，ROS促進(jìn)自噬的活化并抑制凋亡，表現(xiàn)出維持細(xì)胞存活的作用；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)程度較重時(shí)，ROS抑制自噬的活化并促進(jìn)凋亡，表現(xiàn)出促細(xì)胞死亡的作用。 （3）JNK、p38MAPK信號(hào)通路均發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞死亡的作用，而ERK信號(hào)主要介導(dǎo)細(xì)胞的生存過(guò)程。在重度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程中，p38MAPK可能通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體膜電勢(shì)，參與調(diào)控胞內(nèi)ROS的水平，從而影響細(xì)胞的存活；而在輕度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程中上述變化不明顯，可能由其它的信號(hào)通路參與調(diào)控ROS的水平。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R363.1

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本文編號(hào)：1637747