本文選題：日本血吸蟲(chóng)　切入點(diǎn)：TLR2　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：血吸蟲(chóng)�。╯chistosomiasis）是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的人畜共患寄生蟲(chóng)病。血吸蟲(chóng)感染免疫學(xué)近年來(lái)得以快速發(fā)展的一個(gè)重要?jiǎng)恿κ侨藗冊(cè)噲D研制抗血吸蟲(chóng)病疫苗，獲取化療“短效”作用與疫苗接種誘導(dǎo)較“長(zhǎng)效”的免疫預(yù)防作用相結(jié)合的雙重效益來(lái)控制血吸蟲(chóng)病，遺憾的是迄今難有突破。這促使我們考慮到在努力研究和開(kāi)發(fā)血吸蟲(chóng)病疫苗的過(guò)程中，不僅要重視現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)進(jìn)步所帶來(lái)的機(jī)遇，更重要的是要回歸到血吸蟲(chóng)感染免疫學(xué)的基礎(chǔ)層面，即轉(zhuǎn)向基礎(chǔ)科學(xué)發(fā)現(xiàn)，以尋覓血吸蟲(chóng)病疫苗發(fā)展的合理策略和途徑。 隨著感染的進(jìn)展，血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段的抗原調(diào)節(jié)著宿主的免疫應(yīng)答，尤其是蟲(chóng)卵抗原產(chǎn)生后，既下調(diào)了免疫病理反應(yīng)強(qiáng)度，使宿主免遭致死性損害，同時(shí)也保護(hù)了寄生蟲(chóng)本身不遭到完全的免疫清除。輻照曼氏血吸蟲(chóng)尾蚴疫苗免疫小鼠后抗體和CD4+T介導(dǎo)的、IFN-γ依賴(lài)的效應(yīng)機(jī)制是其獲得高保護(hù)力的重要原因。但是大多數(shù)針對(duì)血吸蟲(chóng)病的保護(hù)性機(jī)制研究主要集中于獲得性免疫應(yīng)答的效應(yīng)端事件，特別是CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫以及體液免疫應(yīng)答，而對(duì)天然免疫應(yīng)答的啟動(dòng)端事件則涉及較少。 樹(shù)突狀細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的免疫細(xì)胞，其表面表達(dá)的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors, PRRs），，能特異性識(shí)別病原體表面的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP）從而啟動(dòng)即時(shí)效應(yīng)，并最終決定獲得性免疫效應(yīng)的方向。迄今為止，在曼氏血吸蟲(chóng)感染中有關(guān)天然免疫應(yīng)答的研究多集中在蟲(chóng)卵抗原階段，說(shuō)明為何在產(chǎn)卵之后宿主呈現(xiàn)Th2型優(yōu)勢(shì)應(yīng)答。這些基于蟲(chóng)卵抗原的研究，提示蟲(chóng)源性分子可通過(guò)抗原特異性的PRRs級(jí)聯(lián)通路的靶向作用，啟動(dòng)并支配獲得性免疫應(yīng)答的方向。 本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示，在日本血吸蟲(chóng)急性感染過(guò)程中，與野生型小鼠相比，TLR2-/-小鼠蟲(chóng)荷與卵荷均降低，細(xì)胞免疫應(yīng)答水平顯著增強(qiáng)；而TLR4-/-小鼠則呈現(xiàn)與之相反的表現(xiàn)。這表明TLR2在其中可能起著免疫負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。T細(xì)胞的活化除了需要TCR-抗原肽MHC分子復(fù)合物通過(guò)CD3傳遞第一信號(hào)外，還需要協(xié)同刺激分子傳導(dǎo)的第二信號(hào)。淋巴細(xì)胞正常功能的維持亦需要刺激性與抑制性協(xié)同刺激信號(hào)的共同參與，并決定T細(xì)胞對(duì)抗原特異性刺激的敏感性和應(yīng)答方式。作為抑制性協(xié)同刺激分子的代表，程序性細(xì)胞死亡配體1（Programmed Death Ligand1，PD-L1）和程序性細(xì)胞死亡配體2（ProgrammedDeath Ligand2，PD-L2）均能與活化的T細(xì)胞上的受體程序性細(xì)胞死亡1（Programmed death1,PD-1）結(jié)合，從而抑制T細(xì)胞的活化。 鑒于天然免疫識(shí)別系統(tǒng)中TLR2是識(shí)別蟲(chóng)卵抗原組分的重要受體之一，及其在宿主抵抗感染過(guò)程中可能所起的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，本研究擬采用TLR2基因敲除（TLR2-/-）與野生型C57BL/6J（B6）小鼠為對(duì)照，建立日本血吸蟲(chóng)感染的小鼠模型。為了觀察感染/致病結(jié)果，于感染后6周通過(guò)胸主動(dòng)脈灌注法計(jì)數(shù)成蟲(chóng)數(shù)及消化肝臟計(jì)數(shù)蟲(chóng)卵數(shù)；為了觀察感染后宿主的體液免疫應(yīng)答特征，以間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清中日本血吸蟲(chóng)特異性IgG/IgG1/IgG2a抗體水平；為了觀察感染后宿主的細(xì)胞免疫應(yīng)答特征，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中主要免疫細(xì)胞的比例變化，同時(shí)以熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CD4+、CD8+和NK+細(xì)胞中基因il12、il10、ifng、il4、gzma、gzmb和fasl的mRNA表達(dá)水平。鑒于樹(shù)突狀細(xì)胞在天然免疫中的重要作用亦為了觀察血吸蟲(chóng)抗原對(duì)TLR2表達(dá)的影響，體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中用血吸蟲(chóng)抗原負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞后，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面TLR2的表達(dá)水平，以熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因tlr1、tlr2和tlr6的mRNA表達(dá)水平。為了觀察TLR2缺失對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞上PD-L表達(dá)及T細(xì)胞功能的影響，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血吸蟲(chóng)抗原負(fù)載的樹(shù)突狀細(xì)胞表面PD-L1和PD-L2的表達(dá)情況，以熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因pdl1和pdl2的mRNA表達(dá)水平，同時(shí)采用TLR2封閉實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證；以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染不同時(shí)期CD11c+細(xì)胞中PD-L1和PD-L2及T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)情況。 本研究獲得如下主要結(jié)果: 1.在日本血吸蟲(chóng)急性感染后過(guò)程中，與野生型小鼠相比，TLR2-/-小鼠肝臟總蟲(chóng)卵數(shù)明顯降低。在日本血吸蟲(chóng)感染后6周，TLR2-/-小鼠的成蟲(chóng)總數(shù)和對(duì)數(shù)沒(méi)有差異，但是肝臟總蟲(chóng)卵數(shù)明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2.日本血吸蟲(chóng)感染后，TLR2-/-小鼠抗原特異性IgG/IgG1/IgG2a水平與B6小鼠之間無(wú)明顯差異，提示TLR2未對(duì)抗體應(yīng)答產(chǎn)生明顯的正向或負(fù)向調(diào)節(jié)作用。日本血吸蟲(chóng)感染后6周，TLR2-/-小鼠血清中針對(duì)可溶性成蟲(chóng)抗原（SWAP）和可溶性蟲(chóng)卵抗原（SEA）的特異性抗體IgG、IgG1和IgG2a水平與B6小鼠之間無(wú)明顯差異。 3.日本血吸蟲(chóng)感染后6周，TLR2-/-小鼠呈現(xiàn)較高的細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度，Th1型細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞功能均增強(qiáng)，提示TLR2在宿主抵抗感染過(guò)程中起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用。日本血吸蟲(chóng)感染后6周，觀察B6和TLR2-/-小鼠脾細(xì)胞中主要免疫細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞以及Th1細(xì)胞比例在TLR2-/-小鼠均高于B6小鼠，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Th2細(xì)胞和Tc1細(xì)胞的比例在TLR2-/-小鼠略高于B6小鼠，Tc2細(xì)胞的比例則低于B6小鼠，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TLR2-/-小鼠CD4+細(xì)胞中il12和ifng的mRNA水平顯著高于B6小鼠；CD8+細(xì)胞中殺傷功能相關(guān)基因gzma、gzmb和fasl的mRNA水平顯著高于B6小鼠。 4.日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵抗原可以上調(diào)TLR2的表達(dá)，表明血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵抗原中含有可致TLR2表達(dá)的成分。B6小鼠來(lái)源的CD11c+細(xì)胞，經(jīng)不同發(fā)育階段血吸蟲(chóng)抗原刺激后，SEA顯著上調(diào)tlr2的mRNA表達(dá)水平。檢測(cè)感染后不同時(shí)期B6小鼠脾臟中CD11c+細(xì)胞表面TLR2的表達(dá)比例，隨著感染時(shí)程的進(jìn)展，TLR2的表達(dá)逐漸增加，且感染后9周TLR2的表達(dá)水平顯著高于感染后3周（產(chǎn)卵前）；與0周相比，tlr2的mRNA水平在6周時(shí)顯著升高。 5. SEA以TLR2依賴(lài)的方式誘導(dǎo)DCs上的PD-L2上調(diào)，且日本血吸蟲(chóng)感染TLR2-/-小鼠CD4+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)降低，提示SEA可能通過(guò)誘導(dǎo)DCs表面PD-L2上調(diào)的方式引起T細(xì)胞功能抑制。與B6-BMDCs相比，SEA不能上調(diào)TLR2-/--BMDCs表面PD-L2的表達(dá)且pdl2的mRNA表達(dá)明顯降低。封閉TLR2后，SEA亦不能上調(diào)PD-L2的表達(dá)。在感染后6周和9周，TLR2-/-小鼠CD11c+B220-細(xì)胞表面PD-L2的表達(dá)水平低于B6小鼠，尤其在6周時(shí)顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；TLR2-/-小鼠CD4+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)顯著降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩種小鼠CD8+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。 綜上，感染日本血吸蟲(chóng)后，與野生型小鼠相比，TLR2-/-小鼠呈現(xiàn)較高的細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度，Th1型細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞功能均增強(qiáng)；SEA可能通過(guò)誘導(dǎo)DCs表面PD-L2上調(diào)的方式引起T細(xì)胞的功能抑制從而影響感染轉(zhuǎn)歸。蟲(chóng)卵抗原中的某些成分可能通過(guò)TLR2通路下調(diào)宿主的免疫應(yīng)答，為從血吸蟲(chóng)的蟲(chóng)源性成分中發(fā)現(xiàn)可供研究的新型免疫抑制劑提供了新的思路及相應(yīng)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。結(jié)論：基于TLR2的通路在日本血吸蟲(chóng)感染過(guò)程中發(fā)揮免疫負(fù)性調(diào)節(jié)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 操治國(guó),汪天平,呂大兵;水資源開(kāi)發(fā)引起釘螺擴(kuò)散和血吸蟲(chóng)病蔓延的防制措施[J];熱帶病與寄生蟲(chóng)學(xué);2005年01期

2 田芳,夏超明,駱偉,龔唯,周衛(wèi)芳;協(xié)同刺激分子B7-1/2對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2003年02期

3 周曉農(nóng);林丹丹;汪天平;陳紅根;郭家鋼;梁幼生;邱東川;董興齊;李石柱;;我國(guó)“十二五”期間血吸蟲(chóng)病防治策略與工作重點(diǎn)[J];中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志;2011年01期

4 汪天平;操治國(guó);林丹丹;周曉農(nóng);;“十二五”期間我國(guó)血吸蟲(chóng)病科學(xué)研究重點(diǎn)和方向[J];中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志;2011年02期

5 夏超明;濮翔科;龔唯;駱偉;張惠琴;鄧忠彬;薛智謀;;日本血吸蟲(chóng)感染可誘導(dǎo)共刺激分子(ICOS)轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫應(yīng)答及其病理反應(yīng)[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志;2006年05期

6 王磊;莫紅梅;王淇泓;蔣自衛(wèi);程喻力;劉文琪;李雍龍;;日本血吸蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)卵抗原和可溶性雄蟲(chóng)抗原免疫小鼠PD-1-PD-L的表達(dá)[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志;2008年03期

本文編號(hào)：1633125