本文選題：內(nèi)皮祖細(xì)胞　切入點(diǎn)：microRNA-34a　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：血管新生在整個(gè)生命過(guò)程中都發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,但是隨著年齡的增長(zhǎng),老年個(gè)體的血管新生功能呈現(xiàn)進(jìn)程性減弱,修復(fù)缺血和受損組織的能力顯著降低。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)已被證實(shí)在成體的血管新生中起重要作用,來(lái)源于老年個(gè)體的EPCs其增殖、存活及遷移功能明顯減弱。最近的研究表明microRNAs參與了血管新生的調(diào)控。miR-34a是腫瘤抑制因子,通過(guò)作用于靶蛋白沉默信息調(diào)控子1 (silent information regulator 1, SIRT1)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯或者細(xì)胞凋亡。但是,目前尚不清楚miR-34a是否在EPC介導(dǎo)的血管新生中起作用。此外,最近已報(bào)道m(xù)iR-34a在老年小鼠的心臟和脾臟中水平升高,提示衰老可上調(diào)-miR-34a的水平。EPCs還受到eNOS的調(diào)控,在衰老的情況下eNOS的功能也被削弱。研究證明,eNOS的必需輔因子BH4水平的下降可引起eNOS解偶聯(lián),導(dǎo)致EPCs的數(shù)量及遷移能力降低。GTP水解酶I(GTP cyclohydrolase Ⅰ, GTPCH Ⅰ)是生理情況下合成BH4的限速酶。GTPCH Ⅰ活性的降低可減少BH4的產(chǎn)生,引起eNOS解偶聯(lián),從而導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平升高。但是EPCs中的GTPCH Ⅰ是否可以通過(guò)影響ROS的產(chǎn)生進(jìn)而調(diào)控miR-34a的表達(dá)尚不清楚。本研究旨在探討正常與衰老情況下miR-34a調(diào)控EPCs介導(dǎo)的血管新生及miR-34a的上游調(diào)控因素。首先我們假設(shè)miR-34a通過(guò)抑制SIRT1而削弱了EPCs介導(dǎo)的血管新生。我們?cè)贓PCs中過(guò)表達(dá)miR-34a,分析其對(duì)EPCs生血管功能、靶蛋白SIRT1表達(dá)及下游FoxO1通路的影響,并觀察SIRT1對(duì)于EPCs血管新生的調(diào)控作用。隨后,我們?cè)O(shè)想老年小鼠血管新生能力的減弱與其miR-34a表達(dá)水平的改變相關(guān)。在老年小鼠的EPCs中檢測(cè)miR-34a水平,之后抑制其miR-34a的表達(dá),觀察EPCs的血管新生能力是否改善及靶蛋白SIRT1的表達(dá)變化。我們進(jìn)一步假設(shè)GTPCH Ⅰ可以調(diào)節(jié)EPCs中miR-34a的表達(dá)。在老年eNOS/GCH雙轉(zhuǎn)基因小鼠、GTPCH Ⅰ轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg-GCH)及GTPCH Ⅰ缺乏的Hph-1小鼠的EPCs中測(cè)定miR-34a及SIRTⅠ的表達(dá)。方法：我們分別從成年雄性Spraque-Dawley大鼠(201-225 g)、年輕(8周齡)的C57BL/6小鼠(野生型,WT)、GTPCH Ⅰ轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg-GCH,內(nèi)皮特異性過(guò)表達(dá)GTPCHⅠ)、Hph-1小鼠(GTPCH Ⅰ表達(dá)水平組成型降低)、老年(18-20月齡)的C57BL/6小鼠及eNOS/GCH雙轉(zhuǎn)基因小鼠(全部為雄性)的骨髓中分禺EPCs。用流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志對(duì)培養(yǎng)7d后的細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定。應(yīng)用Real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)miR-34a和SIRT1的表達(dá)水平。miR-34a mimic或inhibitor被轉(zhuǎn)染進(jìn)入EPCs以過(guò)表達(dá)miR-34a或抑制miR-34a的表達(dá)。SIRT1 siRNA也被用來(lái)降低EPCs由SIRT1的水平。我們還應(yīng)用Matrigel小管形成試驗(yàn)檢測(cè)EPCs的體外血管新生能力,用Matrigel plug試驗(yàn)分析EPCs的體內(nèi)血管新生能力,用衰老相關(guān)的β一半乳糖苷酶染色確定EPCs的衰老狀況,用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定ROS水平。小鼠后肢缺血模型結(jié)合隨后的激光多普勒成像用來(lái)評(píng)估小鼠急性缺血后血流的恢復(fù)能力。結(jié)果：(1)niR-34a調(diào)節(jié)大鼠EPCs介導(dǎo)的血管新生。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示,培養(yǎng)7d后的EPCs表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志CD34、CD133和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志VEGFR-2、 VE-Cadherin。Real-time PCR證實(shí)EPCs表達(dá)miR-34a。轉(zhuǎn)染miR-34a mimic后,EPCs中miR-34a水平增加約23倍,伴隨著EPCs勺血管新生功能顯著降低。過(guò)表達(dá)miR-34a還增加了約40%的衰老細(xì)胞,同時(shí)SIRT1勺表達(dá)水平降低了約40%。在EPCs中用SIRT1 siRNA抑制SIRT1的表達(dá)后,EPCs的血管新生能力明顯降低,而衰老細(xì)胞數(shù)增加。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-34a或者敲低SIRT1都能增加SIRT1效應(yīng)蛋白FoxO1的乙�；�,提示SIRT1-FoxO1信號(hào)通路可能介導(dǎo)了niR-34a對(duì)EPCs血管新生的抑制作用。(2)老齡小鼠EPCs血管新生功能下降與miR-34a相關(guān)。老年小鼠在股動(dòng)、靜脈結(jié)扎后血流的恢復(fù)較年輕小鼠明顯減慢。與減緩的血流恢復(fù)相一致,老年小鼠EPCs的體外血管新生能力下降約56%。值得注意的是老年小鼠EPCs中niR-34a水平增加約1倍,而SIRT1蛋白水平下降約46%。在老年小鼠EPCs中轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor抑制miR-34a的表達(dá)后,血管新生能力顯著升高。相反在年輕小鼠EPCs中轉(zhuǎn)染miR-34a mimic過(guò)表達(dá)miR-34a后,其血管新生活性減弱。進(jìn)一步應(yīng)用Matrigel plug試驗(yàn)觀察miR-34a對(duì)EPCs體內(nèi)血管新生的影響。結(jié)果顯示,混有過(guò)表達(dá)miR-34a的EPCs的plug中形成了無(wú)序的細(xì)胞簇,但是混有對(duì)照EPCs的plug中則形成了血管樣結(jié)構(gòu),并且在管腔中可見紅細(xì)胞,表明過(guò)表達(dá)miR-34a會(huì)抑制EPCs的體內(nèi)血管新生功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),抑制miR-34a可增加老年小鼠EPCs中SIRT1的表達(dá),而過(guò)表達(dá)miR-34a則降低年輕小鼠EPCs中SIRT1的含量。(3)GTPCH I調(diào)控rniR-34a和SIRT1的表達(dá)。老年小鼠EPCs中ROS水平顯著升高,而GTPCHI蛋白水平顯著降低。與老年WT小鼠的EPCs相比,老年eNOS/GCH雙轉(zhuǎn)基因小鼠EPCs中miR-34a水平降低,伴隨著SIRT1水平的升高,但與年輕WT小鼠EPCs比較,老年eNOS/GCH雙轉(zhuǎn)基因小鼠EPCs中miR-34a和SIRT1水平無(wú)顯著差異,提示GTPCHI和／或eNOS可能參與了調(diào)控miR-34a及其靶蛋白SIRT1的表達(dá)。最后,我們?cè)赥g-GCH小鼠和GTPCH I缺乏的Hph-1小鼠的EPCs中檢測(cè)了miR-34a和SIRT1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與WT小鼠EPCs相比,Tg-GCH小鼠EPCs中miR-34a水平下降,伴隨SIRT1水平的升高,而在Hph-1小鼠EPCs中miR-34a水平升高,伴隨SIRT1水平的降低。結(jié)論：通過(guò)本研究我們發(fā)現(xiàn)：(1)miR-34a抑制EPCs介導(dǎo)的血管新生；(2)衰老與SIRT1-FoxO1信號(hào)通路介導(dǎo)了niR-34a對(duì)EPCs血管新生功能的抑制作用；(3)老齡小鼠EPCs血管新生功能減弱與miR-34a水平升高及其靶蛋白SIRT1的表達(dá)下降相關(guān)；(4)GTPCH I參與了miR-34a及其靶蛋白SIRT1表達(dá)的調(diào)控。本研究從miRNA調(diào)控EPCs介導(dǎo)的血管新生角度闡明了miR-34a在老年動(dòng)物血管新生能力減弱中的作用機(jī)制,為改善老齡個(gè)體血管新生能力提供了新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R331.32

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本文編號(hào)：1626564