本文選題：肺炎支原體　切入點(diǎn)：p1基因　出處：《中南大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, Mp)感染不僅可引起支原體肺炎、氣管炎、支氣管炎、哮喘等呼吸道疾病,還可導(dǎo)致腦膜腦炎、心肌炎、腎炎、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等肺外感染和并發(fā)癥。Mp感染多見于學(xué)齡兒童及青少年,是兒童社區(qū)獲得性肺炎最主要的病原體,其發(fā)病率逐年上升,占10%-30%,流行期間為30%～50%,且可引起地區(qū)性和世界性流行。雖然大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素可控制Mp感染,但耐藥菌株的不斷增多給臨床治療帶來了困難。因此,利用Mp免疫優(yōu)勢(shì)抗原基因研制疫苗,是預(yù)防和控制Mp感染的關(guān)鍵。 P1粘附素是Mp最主要的粘附蛋白和免疫優(yōu)勢(shì)抗原,其中和抗體能阻止80%以上的Mp粘附到宿主細(xì)胞。由此,P1蛋白是最具潛力的Mp候選疫苗。但由于p1基因中含有RepMP4和RepMP2/3兩個(gè)高度變異的重復(fù)序列,且基因中含有21個(gè)"UGA"密碼子,克隆和表達(dá)p1全基因非常困難。本文分析了p1基因的變異情況,選取了P1蛋白第1125-1395位氨基酸免疫優(yōu)勢(shì)表位區(qū)(P1C蛋白),研究其生物學(xué)活性和其所構(gòu)建的核酸疫苗的免疫活性及白細(xì)胞介素2(interleukin2, IL-2)和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin, LTB)對(duì)p1c核酸疫苗的免疫佐劑效應(yīng)。 目的： 檢測(cè)兒童呼吸道感染患者中分離的159例Mp臨床分離株的基因型,分析p1基因的變異情況,確定p1基因的保守序列。構(gòu)建含Mp P1基因第3373-4185位核苷酸(p1c)的原核表達(dá)載體pGEX6p-2//plc,純化表達(dá)產(chǎn)物免疫BALB/c,制備多克隆抗體(pAb);檢測(cè)其pAb的滴度及對(duì)Mp粘附HeLa細(xì)胞的抑制作用。構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/pklc (pPlC)、pcDNA3.1(+)/plc-IL-2(pPlC-IL-2)和pcDNA3.1(+)/LTB-plc (pLTB-P1C),通過肌肉注射和鼻內(nèi)接種方式免疫小鼠,檢測(cè)疫苗所誘發(fā)的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平；用Mp經(jīng)呼吸道感染疫苗免疫后的小鼠,觀察肺組織病理變化和支氣管灌洗液中Mp菌落計(jì)數(shù),分析疫苗接種小鼠對(duì)Mp感染的免疫保護(hù)作用,為研制Mp核酸疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.復(fù)蘇Mp臨床株,分離培養(yǎng)單個(gè)菌落并進(jìn)行PCR鑒定。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析對(duì)159例Mp臨床株進(jìn)行p1基因分型,并檢測(cè)p1變異。 2.設(shè)計(jì)特異性引物,PCR擴(kuò)增p1基因第3373～4185位核苷酸(p1c基因),構(gòu)建pGEX6p-2/plc原核細(xì)胞表達(dá)重組體,用PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變將p1c基因中的“TGA”突變成“TGG”。重組體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在E.coli BL21中表達(dá)融合蛋白P1C-GST,用高親和力GST Resin親和柱純化P1C-GST蛋白,研究P1C-GST蛋白對(duì)HeLa細(xì)胞的粘附活性；將純化的PIC-GST蛋白免疫BALB/c鼠,制備多克隆抗體(pAb),研究PIC-GST pAb對(duì)Mp的粘附抑制作用。ELISA分析PIC-GST蛋白的免疫原性和抗原性。 3.將p1c基因亞克隆至真核表達(dá)載體構(gòu)建pPIC重組體,并將p1c基因與細(xì)胞因子佐劑IL-2基因和黏膜佐劑LTB基因分別通過一段特殊核苷酸序列(GAT CCG AGA GTA CCG AGC)連接,構(gòu)建pP1C-IL-2和pLTB-P1C雙基因融合表達(dá)重組體。將pP1C和pP1C-IL-2經(jīng)肌肉注射和鼻內(nèi)接種方式免疫小鼠,pLTB-PIC鼻內(nèi)途徑免疫小鼠。用ELISA法檢測(cè)血清和支氣管灌洗液中特異性抗體(IgG、IgA)的水平、IgG抗體亞類和IFN-γ、IL-4水平,用MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞特異性增殖反應(yīng),以分析疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。 4.plc單基因或融合基因疫苗分別免疫小鼠后,將Mp經(jīng)呼吸道感染小鼠,檢測(cè)Mp呼吸道攻擊后小鼠肺組織病理學(xué)改變及支氣管灌洗液中Mp的菌落形成單位,以分析疫苗的免疫保護(hù)效果。 結(jié)果： 1.159例Mp臨床標(biāo)本中,142例為Mp Ⅰ型(89.31%),17例為Mp Ⅱ型(10.69%)；PCR-RFLP法共檢測(cè)出21例臨床突變株,其中10株為Mp V2c突變株；3株為V2a突變株；7株為V1a突變。研究發(fā)現(xiàn)了一株新型V2型突變株Mp100(命名為V2d突變株),其p1基因RepMP4區(qū)最接近309(V2a), RepMP2/3區(qū)域中有142bp(2772-2913)序列完全同源重組了一段p1基因以外的RepMP2/3-J序列(606517-606658)。 2. PCR擴(kuò)增出約813bp的目的片段；構(gòu)建了P1C蛋白原核表達(dá)重組體pGEX6p-2/p1c,通過PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變成功地將P1C基因中的TGA突變?yōu)門GG。原核表達(dá)重組體在E.coli中表達(dá)出一相對(duì)分子量(Mr)約為66kD的目的蛋白,該目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以可溶性形式存在。經(jīng)高親和力GST Resin純化柱純化,得純度達(dá)95%以上的重組蛋白。 3.用純化的P1C-GST免疫BALB/c小鼠,制備了pAb,抗體效價(jià)均在1：4000以上,且能與Mp感染患者血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。 4.粘附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P1C對(duì)HeLa細(xì)胞有粘附活性,粘附抑制試驗(yàn)顯示P1C的pAb可抑制Mp對(duì)HeLa細(xì)胞的粘附,抑制強(qiáng)度與抗體水平呈正相關(guān),抗體滴度越高,抑制作用越強(qiáng)。 5.plc單基因疫苗免疫組、p1c-IL-2雙基因融合疫苗免疫組小鼠經(jīng)肌注和鼻飼免疫后,隨著接種次數(shù)的增多血清抗體水平逐漸升高。第一次免疫后第2w,小鼠血清中可檢測(cè)到特異性抗體,第6w特異性抗體水平顯著升高,第8w抗體水平基本穩(wěn)定,雙基因融合疫苗免疫組血清抗體水平較單基因免疫組高,兩種均與對(duì)照組有顯著性差異(P0.01)。檢測(cè)抗體亞類發(fā)現(xiàn)單基因免疫組IgG1及IgG2a抗體均較高,而雙基因融合疫苗免疫組IgG2a升高更為顯著。融合疫苗經(jīng)鼻飼免疫所誘生的呼吸道局部粘膜抗體顯著高于單基因免疫組(P0.05),肌注免疫組小鼠未產(chǎn)生明顯的黏膜抗體。p1c單基因疫苗免疫組、p1c-IL-2雙基因融合疫苗免疫組支氣管灌洗液中IFN-γ和IL-4水平較對(duì)照組顯著增高(P0.05),且雙基因疫苗組較單基因疫苗組分泌的IFN-γ和IL-4增高更顯著(P0.05)。疫苗免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)均較對(duì)照組強(qiáng)。肌注組小鼠所誘生的血清IgG抗體滴度和淋巴細(xì)胞增殖均強(qiáng)于鼻飼組(P0.05)。 6.用Mp攻擊各免疫組小鼠,plc-IL-2雙基因融合疫苗免疫組小鼠和p1c單基因疫苗組小鼠的肺間質(zhì)炎癥明顯減輕,病變區(qū)域較局限,肺泡間隔輕度增寬,淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)減少。兩組的肺組織炎癥病理評(píng)分明顯低于對(duì)照組；p1c單基因組和plc-IL-2雙基因疫苗免疫組小鼠支氣管灌洗液中Mp的菌落數(shù)較對(duì)照組明顯減少,p1c-IL-2雙基因疫苗免疫組小鼠的Mp菌落數(shù)最少。但兩組肺組織病理評(píng)分和菌落計(jì)數(shù)差異無顯著性(P0.05)。 7.LRB-p1c雙基因融合疫苗組小鼠肺組織炎癥減輕,肺組織病理評(píng)分和Mp菌落數(shù)均低于對(duì)照組,但Mp菌落數(shù)較ple單基因疫苗減少,但差異無顯著性。LTB-p1c組小鼠支氣管灌洗液中的血清總抗體、sIgA和支氣管灌洗液和血清中IFN-γ、IL-4水平明顯高于p1c核酸疫苗組(P0.05)； 8.鼻飼接種LTB-plc免疫組小鼠與plc-IL-2疫苗組相比,支氣管灌洗液中的IFN-γ和IgA顯著增高,但兩組小鼠肺組織炎癥和Mp菌落計(jì)數(shù)差異無顯著性(P0.05)。 結(jié)論： 1.159株Mp臨床株主要為Ⅰ型。21株p1基因發(fā)生突變,Ⅱ型突變率高于I型。發(fā)現(xiàn)一株新的p1基因突變株(V2d)。 2.P1C融合蛋白有粘附活性,并具有較好的免疫原性和抗原性。 3.plc、LTB-plc和plc-IL-2核酸疫苗均能刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性免疫應(yīng)答水平和免疫保護(hù)作用。 4.LTB-plc和plc-IL-2核酸疫苗較p1c單基因疫苗誘導(dǎo)更強(qiáng)的特異性免疫應(yīng)答水平和免疫保護(hù)作用。 4.plc核酸疫苗鼻飼免疫組小鼠支氣管灌洗液產(chǎn)生高水平的IgA,但血清IgG水平低于肌注組,在感染早期發(fā)揮更強(qiáng)的作用。肌注組結(jié)果相反。
[Abstract]:Mycoplasma pneumoniae (Mycoplasma pneumoniae Mp) not only can cause the infection of mycoplasma pneumonia, tracheitis, bronchitis, asthma and other respiratory diseases, can also cause encephalitis, myocarditis, nephritis, atherosclerosis, coronary heart disease, pulmonary infection and complications of.Mp infection is more common in school-age children and adolescents, are the main pathogens in children with community acquired pneumonia. The incidence rate increased year by year, accounting for 10%-30%, the popular period is from 30% to 50%, and can cause regional and worldwide epidemic. Although macrolide antibiotics can control Mp infection, but drug-resistant strains increasing bring difficulties to clinical treatment. Therefore, the use of Mp immunodominant antigen vaccine gene, prevention and the key to control Mp infection.
P1 adhesion is Mp adhesion protein and the major immunodominant antigen and antibody, which can prevent more than 80% of the Mp adhesion to host cells. Thus, P1 protein is the most potential vaccine candidates of Mp. But because of the repeated sequences containing RepMP4 and RepMP2/3 two high variation in the P1 gene, containing 21 UGA "codon and gene, cloning and expression of P1 gene is very difficult. This paper analyzes the variation of P1 gene and P1 protein in 1125-1395 selected amino acid immunodominant epitope region (P1C protein), study its biological activity and DNA vaccine to build their vaccine immune activity and interleukin 2 (interleukin2, IL-2) and Escherichia coli enterotoxin subunit B (B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin, LTB) adjuvant effect on p1c DNA vaccine.
Objective:
With the separation of the 159 cases of clinical isolates of Mp genotype detection in children with respiratory tract infection, mutation analysis of P1 gene, identified the conserved sequence of P1 gene. The P1 gene construct containing Mp 3373-4185 nucleotide (p1c) prokaryotic expression vector pGEX6p-2//plc, the expression products were purified by immuno BALB/c, preparation of polyclonal antibody (pAb); titer of pAb and its inhibitory effect on Mp cells. The adhesion of HeLa to construct the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (+) /pklc (pPlC), pcDNA3.1 (+) /plc-IL-2 (pPlC-IL-2) and pcDNA3.1 (+) /LTB-plc (pLTB-P1C), through intramuscular injection and intranasal inoculation in mice induced by detection vaccine specific humoral and cellular immune response level; Mp vaccine with respiratory tract infection in mice, observe the pathological changes of lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid in the colony count of Mp, analysis of the vaccination of mice immune protection against Mp infection It provides experimental basis for the development of Mp nucleic acid vaccine.
Method錛，

本文編號(hào)：1622890