本文選題：視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤　切入點(diǎn)：樹突狀細(xì)胞　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的：本文通過腫瘤睪丸抗原NY-ESO-1致敏樹突狀細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株HXO-RB44的殺傷作用效果。 研究方法： 1.自行構(gòu)建NY-ESO-1基因的重組質(zhì)粒pDC316/NY-ESO-1，并鑒定其在真核細(xì)胞中的表達(dá)。 2.Ficoll法分離人血獲得單個(gè)核細(xì)胞，通過rhGM-CSF和rhIL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)外周血來源的DCs，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DCs，LPS誘導(dǎo)DCs成熟，成熟DCs刺激特異性CTL細(xì)胞增殖。CTL特異性殺傷HXO-RB44細(xì)胞株，通過MTT法檢測(cè)CTL的增殖以及CTL對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的殺傷作用。 研究結(jié)果： 1.經(jīng)過檢測(cè)重組載體pDC316/NY-ESO-1的目的片段序列與原基因序列完全相同，酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期一致。 2.在細(xì)胞株HXO-RB44中可以檢測(cè)到NY-ESO-1基因的表達(dá)，Western-blot法和免疫熒光可檢測(cè)到NY-ESO-1基因較為強(qiáng)烈的表達(dá)。 3.經(jīng)rhGM-CSF和rhIL-4成功誘導(dǎo)出的外周血DCs，脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pDC316/NY-ESO-1轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)成熟的DCs，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)到轉(zhuǎn)染后DCs表型分子分別是HLA-DR為42.1%,CD80為54.2%，CD83為39.7%，CD86為94.8%。轉(zhuǎn)染后DCs刺激產(chǎn)生的CTL組的增殖能力強(qiáng)于未經(jīng)過轉(zhuǎn)染DCs刺激產(chǎn)生的CTL組。 4.通過將轉(zhuǎn)染后DCs誘導(dǎo)的CTL，未轉(zhuǎn)染DCs誘導(dǎo)的CTL和無DCs的淋巴細(xì)胞三組分別同細(xì)胞株HXO-RB44進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，檢測(cè)到轉(zhuǎn)染后DCs刺激產(chǎn)生的CTL對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株的殺傷效果顯著高于未經(jīng)處理DCs刺激產(chǎn)生的CTL組和無DCs組，且效靶比為75:1(P0.05)時(shí)殺傷率最強(qiáng)。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到NY-ESO-1基因在細(xì)胞株HXO-RB44中較為強(qiáng)烈的表達(dá)，NY-ESO-1在CT抗原中是最能引起體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的抗原，并且也是最具免疫原性的腫瘤抗原之一，通過NY-ESO-1重組質(zhì)粒構(gòu)建，脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DCs誘導(dǎo)的特異性CTL產(chǎn)生，而此種CTL對(duì)細(xì)胞株HXO-RB44具有特異性殺傷作用，，為RB免疫治療提出了一條新的方向，然而此種方法處于探索性研究階段，尚需進(jìn)一步深入研究。
[Abstract]:Objective: to induce specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) to induce cytotoxic effects on retinoblastoma cell line (HXO-RB44) by sensitizing dendritic cells with tumor testicular antigen (NY-ESO-1). Research methods:. 1.Recombinant plasmid pDC316 / NY-ESO-1 of NY-ESO-1 gene was constructed and its expression in eukaryotic cells was identified. 2. Mononuclear cells were isolated from human blood by Ficoll method. DCS derived from peripheral blood were induced by rhGM-CSF and rhIL-4. The recombinant plasmid was transfected with DCs to induce DCs maturation, and mature DCs stimulated the proliferation of specific CTL cells. CTL-specific killing of HXO-RB44 cells was observed. The proliferation of CTL and the cytotoxicity of CTL to retinoblastoma cells were detected by MTT assay. Results of the study:. 1. The sequence of the target fragment of the recombinant vector pDC316/NY-ESO-1 was identical to that of the original gene, and the result of restriction endonuclease digestion was consistent with the expected result. 2. The expression of NY-ESO-1 gene could be detected by Western-blot and immunofluorescence in HXO-RB44. 3. RhIL-4 and rhGM-CSF were successfully induced in peripheral blood DCS and liposome-mediated recombinant plasmid pDC316/NY-ESO-1 was transfected into mature DCS. The phenotypic molecules of DCs after transfection were detected by flow cytometry to be HLA-DR = 42.1 and 54.2% respectively. CD83 was 39.7i and CD86 was 39.7%. After transfection, DCs stimulation was achieved. The proliferative ability of CTL group was stronger than that of CTL group without DCs stimulation. 4. The CTLs induced by DCs, CTL cells without DCs and lymphocytes without DCs were co-cultured with the cell line HXO-RB44, respectively. The killing effect of CTL stimulated by DCs on retinoblastoma cell line was significantly higher than that of CTL group and DCs free group induced by untreated DCs, and the killing rate was the strongest when the ratio of effect to target was 75: 1 (P0.05). Conclusion:. In this study, we found that NY-ESO-1 gene is strongly expressed in HXO-RB44 cell line. NY-ESO-1 is one of the most immunogenicity tumor antigens in CT antigens. NY-ESO-1 is one of the most immunogenicity tumor antigens, and is constructed by NY-ESO-1 recombinant plasmid. Liposome-mediated recombinant plasmid transfection of DCs induces specific CTL production, and this kind of CTL has a specific killing effect on cell line HXO-RB44, which provides a new direction for RB immunotherapy. However, this method is still in the exploratory stage. Further research is needed.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1621573