本文選題：整聯(lián)蛋白　切入點：輪狀病毒　出處：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：膽道閉鎖(biliary atresia, BA)是以新生兒期肝內(nèi)外膽管的炎癥和纖維化梗阻為特征的疾病,其發(fā)病率在活嬰中約為1/5000～8000,研究表明本病具有地域和季節(jié)差異、高齡產(chǎn)婦、多產(chǎn)、早產(chǎn)均與本病發(fā)生有關(guān),男女發(fā)病比例為1：1.25。BA是新生兒期膽汁淤積最常見的原因,且是小兒肝移植最常見的指證,兒童肝移植中大約40-50%為膽道閉鎖患兒。盡管肝門空腸吻合術(shù)(Kasai手術(shù))能夠改善部分患兒的肝外膽道梗阻,重建膽汁引流,但大部分患兒仍發(fā)生進行性膽汁性肝硬化,且有70%-80%的膽道閉鎖患兒最終需接受肝移植手術(shù)。如何提高膽道閉鎖患兒的長期生存率是困擾小兒外科醫(yī)師的難題,而明確膽道閉鎖的病因和發(fā)病機制是提高治療效果的必要前提。 隨著研究的深入,目前關(guān)于BA的病因,主要學(xué)說有感染、免疫、自身免疫、基因?qū)W說等,近年的研究發(fā)現(xiàn),病毒感染與BA的發(fā)病密切相關(guān),尤其是病毒感染所引發(fā)的進行性炎性纖維化病變。輪狀病毒、巨細胞病毒、Ⅲ型呼腸孤病毒、乳頭瘤病毒、皰疹病毒、呼吸道合胞體病毒等均與膽道閉鎖的發(fā)生相關(guān),其中有關(guān)輪狀病毒與膽道閉鎖的關(guān)系最為引人注目。不僅在膽道閉鎖患兒的肝臟中檢測到了輪狀病毒,而且給新生鼠腹腔注射輪狀病毒成功制作出了膽道閉鎖的動物模型,并且動物模型與人類BA患兒的臨床病理特征具有許多相似點,如介導(dǎo)膽管損傷的肝門部炎性細胞因子的種類,肝外膽管損傷的大體形態(tài)學(xué)變化及發(fā)生膽管梗阻的時間依賴性等方面。 輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科,由11個雙鏈RNA染色體組成,含6個結(jié)構(gòu)蛋白和6個非結(jié)構(gòu)蛋白,其引起的早期腹瀉可能是由于NSP4與整聯(lián)蛋白受體結(jié)合進而導(dǎo)致鈣動員并發(fā)生氯離子分泌應(yīng)答,可能機制是由于NSP4從感染細胞向緊鄰的非感染細胞進行擴散從而激活特異性的信號通路。輪狀病毒NSP4(non structural protein4,NSP4)是由第10位基因編碼的初始產(chǎn)物并由175個氨基酸組成的跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜糖蛋白,是最先被發(fā)現(xiàn)的病毒腸毒素,其對病毒的形態(tài)發(fā)生、復(fù)制及致病機理具有重要作用,有研究表明應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默NSP4后將引起病毒蛋白質(zhì)的異常分布,感染性病毒顆粒的減少及空病毒顆粒的增加。研究證實,在輪狀病毒引起的腸道損傷中,NSP4是主要的腸毒素,且輪狀病毒感染后外周血中CD8+淋巴細胞數(shù)量顯著增高。CD8+淋巴細胞是重要的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL),也是細胞免疫主要的效應(yīng)細胞,在機體抗感染免疫和抗腫瘤免疫中起著重要的作用。如果用抗體清除CD8+淋巴細胞,NSP4則不會導(dǎo)致小鼠腸道上皮的損傷。在眾多的免疫細胞中,CD8+淋巴細胞激活在輪狀病毒致新生鼠膽道閉鎖的形成中起重要作用。研究表明,輪狀病毒感染機體后,輪狀病毒的部分抗原被組織中的巨噬細胞吞噬并且將抗原遞呈至CD4+淋巴細胞,從而激活CD8+淋巴細胞,并分泌穿孔素等因子攻擊膽管上皮細胞,造成膽管上皮細胞破壞,并導(dǎo)致被破壞的膽管上皮細胞被巨噬細胞吞噬而將自身抗原遞呈至免疫系統(tǒng),從而造成進一步的損傷。研究發(fā)現(xiàn)用CD4+淋巴細胞抗體清除新生鼠的CD4+淋巴細胞,新生鼠在輪狀病毒感染后仍可發(fā)生膽道閉鎖,但用CD8+淋巴細胞抗體清除CD8+淋巴細胞,新生鼠在感染輪狀病毒后并不發(fā)生膽道閉鎖,說明CD8+淋巴細胞激活在輪狀病毒致新生鼠膽道閉鎖的形成中起重要作用。 CTL抗原決定簇又稱CTL表位(CTL epitope),對于免疫疫苗的設(shè)計具有重要作用。以前的研究表明,只有抗原中的CTL表位才引起有效的CTL免疫應(yīng)答,CTL表位是蛋白抗原經(jīng)抗原遞呈細胞加工處理,繼而與MHC Ⅰ類分子結(jié)合并最終遞呈給T細胞受體識別,引起有效免疫應(yīng)答的短肽,又稱表位肽。雖然有關(guān)輪狀病毒VP6與VP7的CTL表位已有報道,但目前未見NSP4特異性CTL表位的研究報告。 由此我們推測,輪狀病毒引起膽道閉鎖可能與輪狀病毒致腸道損傷一樣是由NSP4激活CD8+淋巴細胞引起的,NSP4及其CTL表位激活了CD8+淋巴細胞,后者對膽管上皮細胞發(fā)生特異性的殺傷作用,從而導(dǎo)致膽管上皮細胞損傷。 本課題擬對NSP4及其CTL表位激活CD8+淋巴細胞、繼而形成對膽管上皮細胞的特異性殺傷作用進行研究,從而弄清NSP4導(dǎo)致膽管上皮細胞損傷的機理,為免疫干預(yù)降低膽道閉鎖的發(fā)生率及改善膽道閉鎖的預(yù)后提供一定的理論依據(jù)。 如果能找到NSP4的CTL表位并有針對性地研制疫苗或抗體,將有望達到預(yù)防或控制輪狀病毒感染的目的而克服輪狀病毒或NSP4疫苗的致病性,從而為通過免疫干預(yù)降低膽道閉鎖的發(fā)生或改善膽道閉鎖的預(yù)后奠定基礎(chǔ)。 第一部分 整聯(lián)蛋白α2β1在輪狀病毒致肝外膽管上皮細胞損傷中的作用 目的：檢測肝外膽管上皮細胞整聯(lián)蛋白的表達類型并進一步探討其在輪狀病毒致肝外膽管上皮細胞損傷中的作用。 方法：取Balb/c小鼠的肝外膽管進行肝外膽管上皮細胞培養(yǎng)至第三天,用直接免疫熒光法檢測整聯(lián)蛋白α2、β1亞基,用間接免疫熒光法檢測α4亞基。用透射電鏡觀察輪狀病毒與肝外膽管上皮細胞的結(jié)合。然后加入相應(yīng)的整聯(lián)蛋白抗體,再加入輪狀病毒,觀察各組引起的細胞病變(Cytopathic effect, CPE),并進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果：用直接免疫熒光法檢測到了整聯(lián)蛋白α2、β1亞基存在于肝外膽管上皮細胞膜表面,用間接免疫熒光法檢測到了α4亞基存在于肝外膽管上皮細胞膜表面。同時透射電鏡觀察到了輪狀病毒與肝外膽管上皮細胞的結(jié)合。加入相應(yīng)抗體阻斷整聯(lián)蛋白α2β1和α4β1后,CPE較對照組明顯減輕,而且CPE在阻斷α2β1組較阻斷α4β1組減輕更為明顯。 結(jié)論：肝外膽管上皮細胞表面表達整聯(lián)蛋白α2、β1和α4亞基并且整聯(lián)蛋白α2亞基的含量可能大于α4亞基的含量,整聯(lián)蛋白α2β1可以介導(dǎo)輪狀病毒感染肝外膽管上皮細胞從而引起細胞損傷。 第二部分 輪狀病毒NSP4與整聯(lián)蛋白α2β1在肝外膽管上皮細胞損傷中的作用 目的：探討輪狀病毒NSP4與整聯(lián)蛋白α2β1在肝外膽管上皮細胞損傷中的作用。 方法：取Balb/c小鼠的肝外膽管進行肝外膽管上皮細胞培養(yǎng)至第3天,用激光共聚焦方法檢測整聯(lián)蛋白α2、β1亞基及輪狀病毒NSP4。用siRNA干擾技術(shù)沉默培養(yǎng)至第3天的肝外膽管上皮細胞的整聯(lián)蛋白α2后加入輪狀病毒,用Real Time RT-PCR方法檢測α2亞基及輪狀病毒NSP4的messenger RNA(mRNA)含量,并進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果：用激光共聚焦方法檢測到了整聯(lián)蛋白α2、β1亞基存在于肝外膽管上皮細胞表面；輪狀病毒NSP4和整聯(lián)蛋白α2亞基從感染細胞向緊鄰的非感染細胞進行擴散；siRNA干擾技術(shù)表明沉默整聯(lián)蛋白α2后輪狀病毒NSP4messenger RNA(mRNA)含量較對照組減低(P0.05)。 結(jié)論：肝外膽管上皮細胞表面表達整聯(lián)蛋白α2、β1且整聯(lián)蛋白α2β1是輪狀病毒NSP4的受體并進一步導(dǎo)致肝外膽管上皮細胞損傷。 第三部分 輪狀病毒NSP4介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在膽道閉鎖鼠模型損傷中的作用 目的：探討表達純化的輪狀病毒NSP4介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在膽道閉鎖鼠模型損傷中的作用。 方法：對出生后24小時內(nèi)的新生鼠腹腔注射表達純化的輪狀病毒NSP4,分別于腹腔注射后7、14天用胞內(nèi)細胞因子染色法檢測肝臟CD8+淋巴細胞釋放的IFN-Y,用乳酸脫氫酶釋放法檢測CD8+淋巴細胞對培養(yǎng)的肝外膽管上皮細胞(感染RRV與未感染RRV組)的殺傷程度,酶聯(lián)免疫斑點法檢測肝臟淋巴細胞釋放的IFN-γ,用ELISA法檢測小鼠外周血清IFN-γ的含量,并研究剔除CD8+淋巴細胞后肝臟淋巴細胞及外周血清釋放IFN-γ的情況及肝外膽管的損傷程度。 結(jié)果：胞內(nèi)細胞因子染色結(jié)果表明NSP4免疫后肝臟CD8+淋巴細胞釋放的IFN-γ含量大于對照組(P0.05)；細胞殺傷實驗結(jié)果表明NSP4免疫后肝臟CD8+淋巴細胞對肝外膽管上皮細的殺傷效應(yīng)明顯強于對照組(P0.05),且對感染了RRV的肝外膽管上皮細胞的殺傷效應(yīng)強于未感染RRV組；酶聯(lián)免疫斑點結(jié)果表明肝臟淋巴細胞釋放的IFN-γ含量大于對照組(P0.05)；外周血清ELISA檢測結(jié)果表明IFN-γ釋放量大于對照組(P0.05)；剔除CD8+T淋巴細胞后肝臟淋巴細胞及外周血清釋放的IFN-γ含量明顯降低(P0.05)并且肝外膽管的損傷程度較阻斷前明顯減輕。 結(jié)論：輪狀病毒NSP4介導(dǎo)的CD8+淋巴細胞引起的免疫反應(yīng)在肝外膽管的損傷中具有重要作用。 第四部分 輪狀病毒NSP4表位肽的預(yù)測與研究 目的：研究并明確輪狀病毒NSP4的CTL表位肽。 方法：運用生物信息學(xué)方法預(yù)測并固相多肽合成輪狀病毒NSP4的CTL表位肽,對出生后24小時內(nèi)的新生鼠腹腔注射合成的NSP4表位肽及激動劑,分別于腹腔注射后7、14天用胞內(nèi)細胞因子染色法檢測肝臟CD8+淋巴細胞釋放的IFN-γ,用乳酸脫氫酶釋放法檢測CD8+淋巴細胞對培養(yǎng)的肝外膽管上皮細胞(感染RRV與未感染RRV組)的殺傷程度,酶聯(lián)免疫斑點法檢測肝臟淋巴細胞釋放的IFN-γ,用ELISA法檢測小鼠外周血清IFN-γ的含量。 結(jié)果：胞內(nèi)細胞因子染色結(jié)果表明NSP4157-170和NSP4144-152較NSP424-32和NSP493-110組肝臟CD8+釋放的IFN-γ明顯增多(P0.05)；細胞殺傷實驗結(jié)果表明NSP4157-170和NSP4144-152較NSP424-32和NSP493-110組肝臟CD8+對肝外膽管上皮細胞的殺傷效應(yīng)明顯強于NSP424-32和NSP493-110組(P0.05),且對感染了RRV的肝外膽管上皮細胞的殺傷效應(yīng)強于未感染RRV組；酶聯(lián)免疫斑點結(jié)果表明NSP4157-170和NSP4144-152較NSP424-32和NSP493-110組肝臟淋巴細胞釋放的IFN-γ明顯增多(P0.05)；外周血清ELISA檢測結(jié)果表明NSP4157-170和NSP4144-152較NSP424-32和NSP493-110組釋放的IFN-γ明顯增多(P0.05)。 結(jié)論；NSP4157-170和NSP4144-152可能是輪狀病毒NSP4的CTL表位肽。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R575.7;R-332

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Expression of NF-kappaB in rotavirus-induced damage to the liver and biliary tract in neonatal mice[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2007年02期

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本文編號：1619913