本文選題：臍帶　切入點：間充質干細胞　出處：《汕頭大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：研究人臍帶間充質干細胞（Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem cells，HuMSCs）轉染腺病毒攜帶外源基因pdx1 ngn3 mafa后，向胰腺前體細胞分化潛能。 方法： 1.人臍帶間充質細胞的培養(yǎng)及鑒定：人臍帶華爾通膠組織塊培養(yǎng)原代huMSCs，傳代培養(yǎng)，流式細胞儀檢測鑒定HuMSCs的表面標記和免疫原性標記。 2.腺病毒的擴增及制備：利用AD293細胞擴增腺病毒，收集到的腺病毒行梯度稀釋后，進行濃度測定，儲存在-70度超低溫冰箱備用。 3.腺病毒攜帶外源基因pdx1、ngn3、mafa轉染HuMSCs及鑒定：腺病毒攜帶β細胞發(fā)育的關鍵轉錄因子（pdx1、ngn3、mafa）體外轉染第三、四代人臍帶間充質干細胞，細胞免疫熒光化學檢測腺病毒是否轉染進入HuMSCs內；CCK-8檢測轉染誘導后HuMSCs增值能力。 4. HuMSCs轉染攜帶外源基因pdx1、ngn3、mafa腺病毒后向胰腺前體細胞分化的鑒定：轉染腺病毒后倒置相差顯微鏡下觀察誘導后細胞形態(tài)學變化，RT-PCR和熒光定量PCR對誘導細胞進行相關基因（glucagon、pdx1、nkx2.2）鑒定。應用2-ΔΔCT比較各組在不同誘導方式，不同時間內源性基因水平。 結果： 1.臍帶間充質（華爾通膠）組織塊原代培養(yǎng)7天，貼壁組織塊周圍有細胞爬出,呈成纖維i叵赴�。留|較赴羌觳獾諶戀諼宕腍uMSCs表面標記，Oct4(45.2%)、CD29(89.64%)、CD59(91.19%)、CD80(0.11%)、CD86(0.08%)、CD40(0.03%)、CD40L(0.07%), 2.腺病毒攜帶三種基因單獨或者是聯(lián)合轉染HuMSCs后，熒光顯微鏡下觀察腺病毒已進入細胞內;CCK-8檢測細胞增值顯示，在感染復數(shù)（MOI）為50的情況下，腺病毒進入細胞內細胞增殖組間無差異。 3.倒置相差顯微鏡下觀察轉染后的HuMSCs細胞培養(yǎng)三天或者七天細胞形態(tài)未見明顯變化；RT-PCR檢測到基因glucogon（GCG）,neuroD1，測序匹配率分別為93.21%，93.91%；熒光定量PCR顯示轉染誘導后HuMSCs表達人源性胰腺前體細胞相關基因glucagon(GCG)、pdx1、nkx2.2基因； 3.1 GCG基因誘導表達：HuMSCs第三天即有三種基因聯(lián)合誘導3天和7天時最高（均為21倍），7天時GCG基因表達水平與三天相比較無明顯差別；mafa與ngn3兩個基因聯(lián)合誘導水平次之三天14倍、七天15倍, mafa在內源性GCG基因產(chǎn)生過稱中起到關鍵作用。 3.2 pdx1基因誘導表達：在3種基因共同聯(lián)合誘導培養(yǎng)三天時最高（15倍），mafa單獨作用轉染誘導pdx1基因表達水平可提高6倍，與pdx1或者是ngn3聯(lián)合作用時并不能促進pdx1基因表達水平；誘導七天時mafa與ngn3協(xié)同作用pdx1基因表達水平最高5倍，ngn3單獨誘導次之；對轉染后培養(yǎng)七天與三天pdx1基因水平進行比較，三種基因聯(lián)合誘導作用條件下pdx1基因無提高，而pdx1單獨誘導培養(yǎng)7天可提高7倍，對于內源性pdx1基因誘導能力最強，隨著培養(yǎng)時間延長，基因表達水平升高。 3.3 nkx2.2基因誘導表達：在ngn3單獨誘導培養(yǎng)三天時最高（8倍），mafa與ngn3聯(lián)合誘導次之（4.5倍）；誘導培養(yǎng)7天時pdx1和mafa聯(lián)合轉染誘導nkx2.2水平無提高、pdx1和ngn3聯(lián)合（2.5倍），其他組pdx1、ngn3、mafa、ngn3與mafa聯(lián)合、三種基因共同作用時轉染誘導nkx2.2基因水平差別無意義2倍。誘導后培養(yǎng)3天和7天時nkx2.2基因水平比較結果為：除ngn3單獨作用和mafa與ngn3聯(lián)合時nkx2.2基因水平無提高外，ngn3對于內源性nkx2.2基因誘導作用在培養(yǎng)至第三天時達到最高水平，隨培養(yǎng)時間延長時間而出現(xiàn)抑制作用，其他組均較3天時提高，pdx1可提高nkx2.2水平為11倍，Pdx1單獨作用時對于內源性nkx2.2基因誘導能力最強，隨著培養(yǎng)時間延長，基因表達水平升高。 結論： 腺病毒攜帶胰島β細胞發(fā)育的三個關鍵基因pdx1、ngn3、mafa單獨或者是聯(lián)合轉染人臍帶間充質干細胞，誘導胰腺早期基因GCG、pdx1、nkx2.2、neuroD1表達。不同外源性基因對特定基因產(chǎn)生過稱中起到關鍵作用，，并且在內源性基因產(chǎn)生過程存在時間差異性和組合內基因的拮抗作用，當基因表達量達到一定程度，不會隨培養(yǎng)時間延長而增加，有待做進一步的研究，探索最佳基因誘導時間及組合方式。該發(fā)現(xiàn)為進一步探索基因治療1型糖尿病治療提供基礎。
[Abstract]:Objective: To study the differentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells (Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem cells, HuMSCs) into pancreatic precursor cells after transfection of adenovirus with PDX1 Ngn3 MafA.
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本文編號：1619171