本文選題：臍帶　切入點(diǎn)：間充質(zhì)干細(xì)胞　出處：《汕頭大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem cells，HuMSCs）轉(zhuǎn)染腺病毒攜帶外源基因pdx1 ngn3 mafa后，向胰腺前體細(xì)胞分化潛能。 方法： 1.人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定：人臍帶華爾通膠組織塊培養(yǎng)原代huMSCs，傳代培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定HuMSCs的表面標(biāo)記和免疫原性標(biāo)記。 2.腺病毒的擴(kuò)增及制備：利用AD293細(xì)胞擴(kuò)增腺病毒，收集到的腺病毒行梯度稀釋后，進(jìn)行濃度測(cè)定，儲(chǔ)存在-70度超低溫冰箱備用。 3.腺病毒攜帶外源基因pdx1、ngn3、mafa轉(zhuǎn)染HuMSCs及鑒定：腺病毒攜帶β細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（pdx1、ngn3、mafa）體外轉(zhuǎn)染第三、四代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測(cè)腺病毒是否轉(zhuǎn)染進(jìn)入HuMSCs內(nèi)；CCK-8檢測(cè)轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)后HuMSCs增值能力。 4. HuMSCs轉(zhuǎn)染攜帶外源基因pdx1、ngn3、mafa腺病毒后向胰腺前體細(xì)胞分化的鑒定：轉(zhuǎn)染腺病毒后倒置相差顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，RT-PCR和熒光定量PCR對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)基因（glucagon、pdx1、nkx2.2）鑒定。應(yīng)用2-ΔΔCT比較各組在不同誘導(dǎo)方式，不同時(shí)間內(nèi)源性基因水平。 結(jié)果： 1.臍帶間充質(zhì)（華爾通膠）組織塊原代培養(yǎng)7天，貼壁組織塊周圍有細(xì)胞爬出,呈成纖維i叵赴�。留|較赴羌觳獾諶戀諼宕腍uMSCs表面標(biāo)記，Oct4(45.2%)、CD29(89.64%)、CD59(91.19%)、CD80(0.11%)、CD86(0.08%)、CD40(0.03%)、CD40L(0.07%), 2.腺病毒攜帶三種基因單獨(dú)或者是聯(lián)合轉(zhuǎn)染HuMSCs后，熒光顯微鏡下觀察腺病毒已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi);CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增值顯示，在感染復(fù)數(shù)（MOI）為50的情況下，腺病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞增殖組間無(wú)差異。 3.倒置相差顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的HuMSCs細(xì)胞培養(yǎng)三天或者七天細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯變化；RT-PCR檢測(cè)到基因glucogon（GCG）,neuroD1，測(cè)序匹配率分別為93.21%，93.91%；熒光定量PCR顯示轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)后HuMSCs表達(dá)人源性胰腺前體細(xì)胞相關(guān)基因glucagon(GCG)、pdx1、nkx2.2基因； 3.1 GCG基因誘導(dǎo)表達(dá)：HuMSCs第三天即有三種基因聯(lián)合誘導(dǎo)3天和7天時(shí)最高（均為21倍），7天時(shí)GCG基因表達(dá)水平與三天相比較無(wú)明顯差別；mafa與ngn3兩個(gè)基因聯(lián)合誘導(dǎo)水平次之三天14倍、七天15倍, mafa在內(nèi)源性GCG基因產(chǎn)生過(guò)稱中起到關(guān)鍵作用。 3.2 pdx1基因誘導(dǎo)表達(dá)：在3種基因共同聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)三天時(shí)最高（15倍），mafa單獨(dú)作用轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)pdx1基因表達(dá)水平可提高6倍，與pdx1或者是ngn3聯(lián)合作用時(shí)并不能促進(jìn)pdx1基因表達(dá)水平；誘導(dǎo)七天時(shí)mafa與ngn3協(xié)同作用pdx1基因表達(dá)水平最高5倍，ngn3單獨(dú)誘導(dǎo)次之；對(duì)轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)七天與三天pdx1基因水平進(jìn)行比較，三種基因聯(lián)合誘導(dǎo)作用條件下pdx1基因無(wú)提高，而pdx1單獨(dú)誘導(dǎo)培養(yǎng)7天可提高7倍，對(duì)于內(nèi)源性pdx1基因誘導(dǎo)能力最強(qiáng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，基因表達(dá)水平升高。 3.3 nkx2.2基因誘導(dǎo)表達(dá)：在ngn3單獨(dú)誘導(dǎo)培養(yǎng)三天時(shí)最高（8倍），mafa與ngn3聯(lián)合誘導(dǎo)次之（4.5倍）；誘導(dǎo)培養(yǎng)7天時(shí)pdx1和mafa聯(lián)合轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)nkx2.2水平無(wú)提高、pdx1和ngn3聯(lián)合（2.5倍），其他組pdx1、ngn3、mafa、ngn3與mafa聯(lián)合、三種基因共同作用時(shí)轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)nkx2.2基因水平差別無(wú)意義2倍。誘導(dǎo)后培養(yǎng)3天和7天時(shí)nkx2.2基因水平比較結(jié)果為：除ngn3單獨(dú)作用和mafa與ngn3聯(lián)合時(shí)nkx2.2基因水平無(wú)提高外，ngn3對(duì)于內(nèi)源性nkx2.2基因誘導(dǎo)作用在培養(yǎng)至第三天時(shí)達(dá)到最高水平，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)間而出現(xiàn)抑制作用，其他組均較3天時(shí)提高，pdx1可提高nkx2.2水平為11倍，Pdx1單獨(dú)作用時(shí)對(duì)于內(nèi)源性nkx2.2基因誘導(dǎo)能力最強(qiáng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，基因表達(dá)水平升高。 結(jié)論： 腺病毒攜帶胰島β細(xì)胞發(fā)育的三個(gè)關(guān)鍵基因pdx1、ngn3、mafa單獨(dú)或者是聯(lián)合轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，誘導(dǎo)胰腺早期基因GCG、pdx1、nkx2.2、neuroD1表達(dá)。不同外源性基因?qū)μ囟ɑ虍a(chǎn)生過(guò)稱中起到關(guān)鍵作用，，并且在內(nèi)源性基因產(chǎn)生過(guò)程存在時(shí)間差異性和組合內(nèi)基因的拮抗作用，當(dāng)基因表達(dá)量達(dá)到一定程度，不會(huì)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，有待做進(jìn)一步的研究，探索最佳基因誘導(dǎo)時(shí)間及組合方式。該發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探索基因治療1型糖尿病治療提供基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: To study the differentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells (Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem cells, HuMSCs) into pancreatic precursor cells after transfection of adenovirus with PDX1 Ngn3 MafA.
Method錛

本文編號(hào)：1619171