本文選題：特異性卵黃抗體　切入點：肺炎克雷伯桿菌　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:制備肺炎克雷伯桿菌特異性卵黃抗體(IgY),考察其體外抑菌活性及對小鼠克雷伯桿菌肺炎的保護作用。 方法:以滅活的肺炎克雷伯桿菌為抗原免疫蛋雞獲得特異性IgY。通過水稀釋、硫酸銨鹽析、硫酸鈉鹽析和超濾等方法分離純化抗體,再經(jīng)冷凍干燥制成凍干粉。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測抗體的純度;采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定卵黃水溶性組分中的抗體效價。采用液體培養(yǎng)基比濁法考察不同濃度的特異性IgY對抗原菌的生長抑制活性。經(jīng)鼻滴入肺炎克雷伯桿菌(2×1011cfu/ml)建立小鼠肺炎模型,攻毒劑量為每只100μl。小鼠隨機分為空白對照組(不感染肺炎克雷伯桿菌)、陰性對照組(生理鹽水)、頭孢哌酮組(1 mg/ml)、地塞米松組(0.5 mg/ml)、特異性IgY高劑量組(40 mg/ml)、特異性IgY低劑量組(20 mg/ml)。攻毒前24h給藥一次,除地塞米松組為每50μl/10g外,其余各組小鼠為150μl/10g;攻毒后每隔24 h給藥一次,連續(xù)四天,除地塞米松組為100μl/10g外,其余各組小鼠為250μl/10g。觀察小鼠的臨床表現(xiàn)、體重、體溫、白細胞計數(shù)、各組小鼠的死亡率、肺組織細菌培養(yǎng)、肺組織外觀及肺病理切片。 結(jié)果:經(jīng)水稀釋、鹽析和超濾得到IgY的純度與標(biāo)準(zhǔn)IgY相近。ELISA檢測表明首次免疫后40～45天效價達到1600。體外抑菌試驗表明,特異性IgY濃度在1～20 mg/ml之間能抑制肺炎克雷伯桿菌的生長且呈劑量依賴性,但其活性低于陽性對照頭孢哌酮。肺炎克雷伯桿菌攻毒后,除空白對照組外,各組小鼠體溫、體重、外周血中WBC數(shù)均有不同程度下降,IgY治療組的下降明顯低于陰性對照組,與陽性對照頭孢哌酮組和地塞米松相近;除空白對照組外,其余各組小鼠肺組織細菌培養(yǎng)均呈陽性;IgY治療組和陽性對照組細菌計數(shù)低于陰性對照組;肺組織有不同程度的損傷,肺病理切片顯示肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺纖維化,IgY治療組和陽性組損傷程度低于陰性組;各組小鼠四天的死亡率分別為:空白對照組為0,陰性對照組為90%,其余均為80%。 結(jié)論:實驗中采用的分離純化方法可獲得高純度的IgY。所制備的特異性IgY具有高效價和明顯的體外抑菌活性。特異性IgY對小鼠肺炎克雷伯桿菌肺炎有保護作用。
[Abstract]:Aim: to prepare the specific egg yolk antibody of Klebsiella pneumoniae and to investigate its antibacterial activity in vitro and its protective effect on Klebsiella pneumoniae pneumonia in mice. Methods: layer hens were immunized with inactivated Klebsiella pneumoniae as antigen. The antibody was purified by water dilution, ammonium sulfate salting out, sodium sulfate salting out and ultrafiltration. Then freeze-dried powder was prepared. The purity of antibody was detected by polyacrylamide gel electrophoresis. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) was used to determine the titer of antibodies in water soluble components of yolk. The growth inhibitory activity of specific IgY at different concentrations against antigenic bacteria was investigated by liquid medium turbidimetry. A mouse model of pneumonia was established by 2 脳 1011cfurml. Mice were randomly divided into blank control group (no infection with Klebsiella pneumoniae), negative control group (normal saline, cefoperazone group 1 mg / ml), dexamethasone group (0.5 mg / ml), specific IgY high dose group (40 mg / ml), specific IgY. In the low dose group, 20 mg / ml of the drug was given once 24 hours before the attack. With the exception of dexamethasone group, the other mice were 150 渭 l / 10 g every 50 渭 l / 10 g, administered every 24 hours for four days, with the exception of dexamethasone group (100 渭 l / 10 g), the other groups were 250 渭 l / 10 g. The clinical manifestations, body weight, body temperature, white blood cell count were observed. Mortality, bacterial culture of lung tissue, appearance of lung tissue and pathological section of lung in each group. Results: the purity of IgY obtained by water dilution, salting out and ultrafiltration was similar to that of standard IgY. Elisa test showed that the titer of IgY reached 160045 days after the first immunization. The bacteriostatic test in vitro showed that the purity of IgY was similar to that of standard IgY. The specific IgY concentration of 20 mg/ml could inhibit the growth of Klebsiella pneumoniae in a dose-dependent manner, but its activity was lower than that of the positive control group cefoperazone. The number of WBC in peripheral blood of IGY group was significantly lower than that of negative control group, which was similar to that of cefoperazone group and dexamethasone group, except for blank control group. The count of bacteria in the other groups was lower than that in the negative control group, and the lung tissue was damaged in different degree, and the alveolar structure was damaged by pathological sections of the lung, and the number of bacteria in the positive control group and the positive control group were lower than those in the negative control group. The degree of injury in IGY group and positive group was lower than that in negative group, and the mortality of four days in each group was 0 in the blank control group, 90 in the negative control group, and 80 in the rest. Conclusion: the method of isolation and purification can obtain high purity IgY. the specific IgY prepared has high titer and obvious antibacterial activity in vitro. The specific IgY has protective effect on Klebsiella pneumoniae pneumonia in mice.
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

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本文編號：1607261