本文選題：結(jié)核分枝桿菌　切入點：抗原蛋白　出處：《揚州大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis, TB)主要是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)復(fù)合物引起的一類以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性人獸共患傳染病病。該復(fù)合物主要成員包括主要引起人TB的MTB以及引起牛結(jié)核病的牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis, M. bovis)。上世紀(jì)80年代以來,由于人口增長、移民、HIV共感染及耐藥強毒株廣泛傳播等因素的影響,TB在世界范圍內(nèi)再次流行。估計全球有20億人感染,活動性肺結(jié)核病人2000余萬,且每年新增800-900萬TB病例,死亡200萬人左右。牛結(jié)核病不僅嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的健康發(fā)展,同樣也會導(dǎo)致部分人TB的發(fā)生。作為主要疾病負(fù)擔(dān)和致死因素之一,TB日益成為嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題并引起國際社會的廣泛關(guān)注。 TB防控需要有效的疫苗和特異性診斷試劑�？ń槊�(BCG)作為人類唯一使用的抗TB疫苗在兒童TB和彌散性TB中效果良好,但對成人肺結(jié)核保護效果不佳(0-80%),且BCG免疫會干擾TB的皮試診斷。因此,鑒定病原特異性的抗原對發(fā)展新型抗TB保護性疫苗和特異性診斷試劑顯得尤為必要。比較基因組學(xué)等的發(fā)展提供了大量特異性抗原信息,它們的免疫特性評價常用于鑒定新型抗TB疫苗候選抗原和診斷試劑。本研究應(yīng)用原核系統(tǒng)表達(dá)和純化了7種結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白,對其中5種重組蛋白進(jìn)行了免疫特性分析,同時利用間接ELISA方法,評價和比較其在牛結(jié)核病血清學(xué)診斷中的潛能。 1.結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白的表達(dá)和鑒定 參考比較基因組學(xué)信息,選取6種MTB抗原蛋白(MPT64、MPT63、MPT83、CFP32、 MPT51和MPT53),首先通過PCR擴增相應(yīng)的編碼基因序列,經(jīng)克隆篩選和測序鑒定正確后,利用pET30a質(zhì)粒構(gòu)建原核表達(dá)載體。將鑒定正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子,再以IPTG誘導(dǎo)表達(dá),對以胞內(nèi)可溶性表達(dá)的上述6種抗原蛋白及ESAT-CFP10融合蛋白(本室保存)進(jìn)行親和層析純化。定量測定和分析純化產(chǎn)物濃度和純度,并通過Western blotting試驗分析融合蛋白的免疫原性。 SDS-PAGE結(jié)果顯示誘導(dǎo)后各目的蛋白均成功表達(dá),且主要以可溶形式存在,灰度分析顯示各目的蛋白表達(dá)量約占裂解上清總蛋白的30%左右(分別為34.8%、32.7%、27.4%、27.8%、30.6%、31.5%和30.2%),而純化后融合蛋白的純度,除MPT53(69.8%)外其余均在90%以上(其中MPT64為92.7%、MPT63為95.6%、MPT83為96.6%、CFP32為91.8%、MPT51為92.3%、ESAT-6-CFP10為96.6%)。Western blotting結(jié)果顯示,在各融合蛋白處均出現(xiàn)特異性目的條帶,表明其具有較好的免疫反應(yīng)性。 2.五種融合蛋白的細(xì)胞免疫學(xué)特性分析 以ESAT-CFP10、MPT64、MPT63、MPT83、CFP32五種融合蛋白分別皮下免疫C57BL/6小鼠,二免兩周后取脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫學(xué)測定。將淋巴細(xì)胞直接標(biāo)記PE-CD4/CD69-FITC和APC-CD8α/CD69-FITC利用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+和CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá),結(jié)果顯示五種蛋白均能引起兩類淋巴細(xì)胞亞群CD69表達(dá)量上調(diào),且MPT63和ESAT-6-CFP10刺激CD4+T細(xì)胞表達(dá)CD69的能力顯著高于其他幾種蛋白。利用ELISPOT試驗分析五種蛋白作刺激劑活化淋巴細(xì)胞分泌IFN-y和IL-4能力,結(jié)果顯示ESAT-6-CFP10與MPT63刺激細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力最強,ESAT-6-CFP10和CFP32刺激細(xì)胞產(chǎn)生IL-4的能力最強,而MPT64刺激細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的能力在所有蛋白中最弱。比較同一種蛋白活化特異淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y和IL-4的能力,結(jié)果顯示ESAT-6-CFP10和MPT63蛋白刺激細(xì)胞分泌IFN-γ的能力顯著大于IL-4,呈Th1免疫應(yīng)答趨勢；MPT83和MPT64蛋白則相反,呈Th2免疫應(yīng)答趨勢；而CFP32蛋白刺激細(xì)胞分泌兩種細(xì)胞因子的能力相當(dāng),呈現(xiàn)Thl/Th2免疫平衡趨勢。同時,通過夾心ELISA方法對各融合蛋白刺激后的細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4含量進(jìn)行定量分析,也得到與ELISPOT試驗相似的結(jié)果。 3.五種融合蛋白的牛結(jié)核診斷價值評價 在淋巴細(xì)胞增殖試驗中,以ESAT-CFP10、MPT64、MPT63、MPT83、CFP32五種融合蛋白作為刺激原,與PPD同步刺激臨床采集的25份奶牛尾靜脈血,再用IFN-y試劑盒檢測其活化抗原特異性細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y的水平。均值和線性回歸分析的結(jié)果顯示5種蛋白中ESAT-6-CFP10刺激IFN-y的產(chǎn)生與Bovine PPD的相關(guān)性最高,MPT63蛋白的相關(guān)性次之。以0.280作為蛋白刺激陽性反應(yīng)的切割值,其陽性率與試劑盒陽性符合率由高到低依次為ESAT-6-CFP10、MPT63、MPT83、MPT64和CFP32。 同時以上述5種蛋白作為包被抗原,建立間接ELISA方法,通過檢測臨床牛血漿上清中特異性抗體以評價它們用于牛結(jié)核血清學(xué)診斷的潛在應(yīng)用價值。各蛋白的陽性檢出率如下：MPT64為8.40%(20/238),MPT63為9.66%(23/238),MPT83為17.65%(42/238), CFP32為11.34%(27/238),ESAT-6-CFP10為2.52%(6/238),顯示MPT83和CFP32血清學(xué)檢測的敏感性較高。將各蛋白的間接ELISA結(jié)果與IFN-γ試劑盒的結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果顯示兩種方法的陰性符合率均值超過90%(MPT64為96.84%、MPT63為94.68%、MPT83為90.43%、CFP32為90.43%、ESAT-6-CFP10為100%),說明這些蛋白的血清學(xué)ELISA方法用于牛結(jié)核的輔助診斷具有較高特異性。
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【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1587006