發(fā)布時間：2018-03-08 04:20

  本文選題：絨毛膜　切入點：糖皮質(zhì)激素　出處：《第二軍醫(yī)大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究證實，前列腺素（prostaglandin，PG）作為誘發(fā)子宮收縮的主要內(nèi)源性因子，通過促進宮頸成熟、誘發(fā)破膜、啟動和維持子宮肌收縮等作用，參與了人類的分娩過程。前列腺素合成關(guān)鍵酶為前列腺素H合成酶（prostaglandin H synthetase，PGHS），而其代謝主要通過NAD依賴的15－羥基前列腺素脫氫酶（15-hydroxyprosglandindehydrogenase,PGDH）轉(zhuǎn)化為無活性的15－酮基代謝產(chǎn)物。妊娠期間前列腺素主要來源于宮內(nèi)組織，如羊膜、絨毛膜和胎盤等。研究證明羊膜高表達PGHS，可以合成高濃度PG，而絨毛膜不僅表達PGHS，還高表達PGDH，因此在妊娠期間絨毛膜作為一個代謝屏障調(diào)控羊膜及其自身產(chǎn)生的前列腺素向子宮肌的轉(zhuǎn)運。因此，妊娠期間羊膜和絨毛膜產(chǎn)生的前列腺素主要被絨毛膜的PGDH所降解，到達子宮的量很少。但臨近分娩時，一方面，羊膜和絨毛膜PGHS表達增加，另一方面，絨毛膜PGDH表達減少，導致胎膜來源的前列腺素到達子宮的量顯著增加。研究證實早產(chǎn)患者絨毛膜PGDH顯著地低于同孕齡正常孕婦絨毛膜，說明絨毛膜PGDH表達減少可能是子宮發(fā)動收縮的重要原因。 雖然目前關(guān)于絨毛膜PGDH的調(diào)節(jié)機制尚未完全闡明，但近年來的研究提示絨毛膜PGDH的表達主要受到宮內(nèi)產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)，如糖皮質(zhì)激素和孕激素，孕激素促進絨毛膜PGDH的表達，而糖皮質(zhì)激素的作用則與之相反——抑制PGDH的表達，即兩者在調(diào)節(jié)前列腺素代謝方面呈拮抗作用，而其作用機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，孕激素均可以和GR、PR結(jié)合，而生理濃度GC僅和GR結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，且絨毛膜滋養(yǎng)層細胞既可表達GR，也可表達兩型PR：PRA和PRB。那么上述GC和孕激素對絨毛膜PGDH調(diào)節(jié)的拮抗作用究竟是通過哪型受體實現(xiàn)的呢？即GR、PRA和PRB等各型受體在孕激素、GC調(diào)節(jié)絨毛膜上PGDH過程中發(fā)揮何種調(diào)節(jié)作用，目前并不清楚。因此課題的第一部分利用原代培養(yǎng)的絨毛膜滋養(yǎng)細胞，首先通過構(gòu)建siRNA和受體表達載體等方法分別使使細胞GR、PR的表達敲低或過度表達，明確GC和孕激素調(diào)控絨毛膜PGDH表達的受體機制；進而在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建含不同長度的PGDH啟動子序列的報告基因轉(zhuǎn)染細胞，推測GC和孕激素調(diào)控PGDH表達的關(guān)鍵序列。 過氧化物酶體增殖體激活受體（peroxisome proliferation-activated receptors，PPARs）屬于配體激活性核激素受體超家族，存在三個亞型：PPARα、PPARβ和PPARγ，PPARs各亞型在人絨毛膜上均有表達。研究證實PPARs不僅參與滋養(yǎng)層細胞分化、胚胎植入、脂質(zhì)和葡萄糖代謝及血管發(fā)生等過程，還與分娩過程密切相關(guān)。不同子宮收縮狀態(tài)或分娩進展時，PPARs各亞型的表達和DNA結(jié)合活性有差異。PPARs還可以通過下調(diào)胎膜COX-2和sPLA2的表達來降低前列腺素的濃度，從而維持妊娠期間子宮的靜息狀態(tài)，說明PPARs參與前列腺素合成的調(diào)節(jié)，那么PPARs是否影響PG的代謝即是否調(diào)節(jié)絨毛膜PGDH的表達和活性？本課題第二部分利用原代培養(yǎng)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞，研究不同PPARs對絨毛膜PGDH表達的調(diào)節(jié)作用及其分子機制。 硫化氫（hydrogen sulphide，H2S）是人類發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號分子，具有舒張血管平滑肌、緩解肺動脈高壓、抗心肌缺血、參與炎癥反應等多種功能�，F(xiàn)在對于H2S的研究還主要集中在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和炎癥反應等方面，而在生殖系統(tǒng)中關(guān)于H2S研究才剛剛起步。Patel等人在2009年首次發(fā)現(xiàn)人類宮內(nèi)組織如子宮肌、絨毛膜及胎盤中均有CBS和CSE的表達，并可以產(chǎn)生內(nèi)源性H2S，低氧時人胎盤H2S生成增加，從而推測H2S可能參與子癇前期的發(fā)病過程，但并未進一步研究。因此本課題第二部分，我們收集正常足月臨產(chǎn)、正常足月未臨產(chǎn)及妊娠期高血壓疾�。ㄎ磁R產(chǎn)）的絨毛膜及羊膜組織，檢測其中的H2S生成率及H2S合成酶CSE、CBS在不同妊娠狀態(tài)胎膜（包括絨毛膜和羊膜組織）上的表達。 主要實驗結(jié)果如下： 第一部分、糖皮質(zhì)激素和孕激素調(diào)節(jié)絨毛膜前列腺素代謝酶PGDH的機制研究 1.免疫組織熒光技術(shù)證實絨毛膜滋養(yǎng)細胞上有PR的表達。臨產(chǎn)分娩所得絨毛膜組織PGDH和PRB mRNA和蛋白表達量顯著低于未臨產(chǎn)分娩所得絨毛膜組織表達量；而臨產(chǎn)分娩所得絨毛膜組織PRA和GR mRNA和蛋白表達量顯著高于未臨產(chǎn)分娩所得絨毛膜組織表達量，提示PR和GR表達的改變可能參與了分娩啟動過程。統(tǒng)計軟件分析表明，臨產(chǎn)和未臨產(chǎn)絨毛膜組織GR、PGDH蛋白的表達呈負相關(guān)，提示糖皮質(zhì)激素可能通過GR抑制了絨毛膜上PGDH的表達。 2.用人工合成的糖皮質(zhì)激素Dexamethasone（Dex）、孕激素P4及孕激素合成酶3β-HSD抑制劑Trilostane（Tril）處理細胞，發(fā)現(xiàn)Dex和Tril呈劑量依賴性方式下調(diào)絨毛膜滋養(yǎng)PGDH mRNA和蛋白表達及其酶活性；而P4則劑量依賴性上調(diào)PGDHmRNA和蛋白表達及其活性。提示內(nèi)源性孕激素對絨毛膜PGDH的表達可能起維持作用，外源性孕激素可以促進其表達和活性，糖皮質(zhì)激素作用與之相反。 3. GR干擾或PRB過表達后，PGDH的蛋白表達及其酶活性均上調(diào)，而PRA過表達后PGDH的蛋白表達及其酶活性下調(diào)，提示A、B兩型PR受體對PGDH的蛋白表達作用相反。GR干擾和PRB過表達后，P4處理組PGDH蛋白表達及其酶活性進一步上調(diào)，提示孕激素通過與PRB結(jié)合上調(diào)PGDH的蛋白表達及其酶活性。而在PRA過表達后，P4表現(xiàn)出對PGDH的抑制效應，提示P4與PRA結(jié)合抑制了PGDH的表達。當過表達PRA或PRB后，Dex對PGDH蛋白表達和酶活性的抑制效應均存在，而GR干擾后，Dex對PGDH蛋白表達和酶活性的抑制效應消失，提示Dex主要通過與GR結(jié)合發(fā)揮對PGDH的抑制作用，而可能并不通過與PR結(jié)合發(fā)揮效應。 PR干擾或GR過度表達后，PGDH蛋白的基礎(chǔ)表達及活性均下調(diào)，在此基礎(chǔ)上，分別用Dex和P4處理細胞， PGDH蛋白表達和活性進一步下調(diào)，提示Dex和P4均能通過與GR結(jié)合抑制PGDH蛋白表達和活性；而用Tril處理細胞，PGDH蛋白表達和活性與轉(zhuǎn)染空載體并用Tril處理細胞相比，并無明顯差異。提示內(nèi)源性孕激素主要維持PGDH的蛋白表達和酶活性。 總結(jié)：P4與PRB結(jié)合促進絨毛膜上PGDH的表達，與PRA、GR結(jié)合抑制其表達，Dex對絨毛膜PGDH的抑制作用主要通過GR實現(xiàn)，可能并不與PR結(jié)合。 4.將含有不同長度PGDH基因的熒光素酶報道基因表達載體轉(zhuǎn)染原代絨毛膜滋養(yǎng)層細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dex和Tril對含有2368bp和2038bp PGDH啟動子的報道基因轉(zhuǎn)錄活性有明顯地抑制作用，而P4則呈促進作用；Dex、 P4和Tril對含有1024bp、388bp和233bpPGDH啟動子的報道基因轉(zhuǎn)錄活性三者都沒有調(diào)節(jié)作用。提示2368bp至1024bp之間含有Dex、P4與Tril調(diào)節(jié)PGDH基因表達的關(guān)鍵序列。 第二部分、不同亞型過氧化酶體增殖物激活受體對絨毛膜PGDH表達的調(diào)節(jié)作用及其機制 1．用不同濃度的PPARα、PPARβ、PPARγ各特異性激動劑GW7467、GW0742、Rosiglitazone（10-9～10-6M）及其各特異性拮抗劑GW6471、GSK0661、GW9662（10-9～10-6M）單獨處理細胞，結(jié)果表明不同亞型PPARs均能促進絨毛膜PGDHmRNA和蛋白的表達，且以PPRγ的促進作用最強；各亞型的特異性拮抗劑均能劑量依耐性抑制PGDH mRNA和蛋白的表達，且特異性拮抗劑均能逆轉(zhuǎn)相對應的激動劑對PGDH mRNA和蛋白表達的促進作用。提示PPARs激動劑可以促進絨毛膜上PGDH的mRNA和蛋白表達 2.分別干擾細胞PPARα、PPARβ、PPARγ的表達后，PGDH蛋白表達均下降，再給予相對應的特異性激動劑GW7467、GW0742、Rosiglitazone（10-7M）處理細胞，GW7467、GW0742、Rosiglitazon不能繼續(xù)上調(diào)絨毛膜PGDH的蛋白表達。說明上述藥物上調(diào)絨毛膜PGDH表達的作用是分別通過PPARα、β、γ實現(xiàn)的。提示PPARs對PGDH表達的上調(diào)作用并非激動劑的藥物作用，可能是PPARs本身的效應。 3.用RXR激動劑9-cis-RA處理細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9-cis-RA呈劑量依耐性促進PGDH mRNA和蛋白表達，且對PPARs上調(diào)PGDH mRNA表達的作用具有增強的趨勢，提示PPARs對PGDH表達的調(diào)節(jié)作用可能是通過與RXR形成異源二聚體而實現(xiàn)。 4.給予蛋白合成抑制劑CHX（10-5M）預處理細胞1小時，再給予GW7467、GW0742、Rosiglitazone處理，結(jié)果PPARs激動劑仍能上調(diào)PGDHmRNA的表達。提示PPARα、β、γ對絨毛膜PGDH mRNA表達的調(diào)節(jié)作用不需要合成新蛋白，可能是對PGDH的直接作用。 5. PPARs激動劑和mRNA合成抑制劑DRB先后處理細胞不同時間，結(jié)果顯示PPARs激動劑絨毛膜細胞PGDHmRNA半衰期，說明不同亞型PPARs對PGDH mRNA表達的上調(diào)作用，不是通過影響PGDH mRNA的穩(wěn)定性實現(xiàn)的。 6.收集正常足月臨產(chǎn)、未臨產(chǎn)絨毛膜組織，檢測PPARs三種亞型各自的mRNA和蛋白的表達。結(jié)果顯示未臨產(chǎn)分娩所得絨毛膜組織PPARγ mRNA和蛋白表達量顯著低于臨產(chǎn)分娩所得絨毛膜組織，而PPARα、β mRNA和蛋白表達則無明顯差異。臨產(chǎn)后PGDHmRNA和蛋白表達是顯著下降的，提示在體情況下，妊娠晚期PPARs中可能由于γ亞型的表達下降引起絨毛膜PGDH表達的減少，宮內(nèi)組織局部前列腺素濃度升高，這可能是PPARγ參與分娩啟動的機制之一。 第三部分、硫化氫及其合成酶在不同妊娠狀態(tài)胎膜的表達 1．免疫組織化學染色顯示人絨毛膜組織及羊膜組織均表達H2S合成酶--CBS和CSE，且絨毛膜上主要表達于合體滋養(yǎng)層細胞，而羊膜主要表達于上皮細胞。 2．收集正常足月臨產(chǎn)、正常足月未臨產(chǎn)及未臨產(chǎn)子癇前期（preeclampsia，PE）的絨毛膜及羊膜組織，檢測其H2S生成率及其合成酶CSE、CBS在胎膜（包括絨毛膜和羊膜組織）上蛋白和mRNA的表達。結(jié)果顯示，，正常足月臨產(chǎn)組胎膜硫化氫生成率及CSE、CBS蛋白和mRNA的表達較正常未臨產(chǎn)組明顯下降，PE患者胎膜CBS和CSE mRNA及蛋白表達、H2S的生成速率較正常者也顯著減少。提示在人胎膜H2S可能參與分娩啟動和子癇前期的病理過程。 結(jié)論： 1.孕激素和糖皮質(zhì)激素可以通過與不同受體結(jié)合，發(fā)揮對PGDH的不同調(diào)節(jié)作用，二者共同調(diào)節(jié)絨毛膜上PGDH的表達，從而影響絨毛膜前列腺素的濃度，這可能是孕激素和糖皮質(zhì)激素參與妊娠維持和分娩啟動的機制之一。糖皮質(zhì)激素和孕激素對PDGH的這些調(diào)節(jié)作用可以通過影響PGDH的啟動子來實現(xiàn)，啟動子-2368至-1024之間這段堿基序列含有PGDH基因表達的關(guān)鍵序列。 2. PPARs三種亞型均可促進絨毛膜滋養(yǎng)細胞上PGDH的表達，這種調(diào)節(jié)作用無需新蛋白參與，也不影響PGDH mRNA的穩(wěn)定性，而是通過直接調(diào)節(jié)PGDH的基因轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)的。在臨產(chǎn)的絨毛膜組織中PPARγ的mRNA及蛋白表達明顯下降，而PPARα、PPARβ的表達無明顯差異，提示絨毛膜上PPARγ亞型臨產(chǎn)前后的變化可能與分娩啟動過程相關(guān)。 3． H2S及其合成相關(guān)酶CBS、CBS在不同妊娠狀態(tài)的人胎膜組織中表達不同，人胎膜H2S可能參與分娩啟動和子癇前期的發(fā)病。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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本文編號：1582385