本文選題：羅非魚　切入點(diǎn)：T淋巴細(xì)胞　出處：《西南大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：T淋巴細(xì)胞可介導(dǎo)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答,在機(jī)體的免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)中具有重要地位與作用。硬骨魚類是同時(shí)擁有非特異性免疫應(yīng)答與特異性免疫應(yīng)答的最原始脊椎動(dòng)物。硬骨魚類免疫相關(guān)研究不僅有助于從分子進(jìn)化角度深化對(duì)免疫分子的認(rèn)識(shí)與理解,而且在魚類病害防治方面具有重要意義。目前,已有大量研究相繼從不同種類硬骨魚類分離、鑒定免疫細(xì)胞相關(guān)分子,極大推進(jìn)了魚類分子免疫的相關(guān)研究；但是,一直以來,硬骨魚類由于缺乏淋巴細(xì)胞特異分子標(biāo)志的檢測(cè)抗體,因此,對(duì)T淋巴細(xì)胞及其亞群的分化發(fā)育、功能、調(diào)控機(jī)制等方面的認(rèn)識(shí)仍處于起步階段。羅非魚作為世界性的養(yǎng)殖性魚類,目前尚未見對(duì)其T淋巴細(xì)胞分子標(biāo)記的克隆及鑒定等方面的相關(guān)報(bào)道。鑒于此,本研究以羅非魚(在本研究中,如未特殊說明,用于實(shí)驗(yàn)研究的羅非魚均指尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus))為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,一方面克隆T淋巴細(xì)胞特異分化抗原CD33γ/δ、CD4、CD8αcDNA序列,并對(duì)其組織表達(dá)模式進(jìn)行初步研究：另一方面,分別構(gòu)建羅非魚CD3γ/δ、CD4、CD8α、Foxp3部分區(qū)段的原核表達(dá)載體,并對(duì)其原核表達(dá)條件進(jìn)行初步探索。 主要研究結(jié)果如下： 1.通過生物信息學(xué)分析與RT-PCR方法相結(jié)合,從羅非魚克隆T淋巴細(xì)胞的幾種標(biāo)志基因CD3y/δ、CD4和CD8a的cDNA序列,結(jié)果顯示： 1)羅非魚CD3y/δ由6個(gè)外顯子組成,cDNA長(zhǎng)620 bp,其中5’端UTR86 bp,3’端UTR 18 bp,ORF 516 bp,編碼171個(gè)氨基酸,其中包括信號(hào)肽27個(gè)氨基酸、胞外區(qū)68個(gè)氨基酸、跨膜區(qū)23個(gè)氨基酸與胞內(nèi)區(qū)53個(gè)氨基酸；系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,羅非魚CD3γ/δ與哺乳動(dòng)物的CD3γ、CD3δ、CD3ε各自聚為不同的枝,而與鱖魚(Siniperca chuatsi)、大西洋鮭(Salmo salar)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、河豚(Takifugu rubripes)、東方渶(Tetraodon nigroviridis)等在內(nèi)的硬骨魚類CD3γ/δ同聚為一枝,其氨基酸序列的相似度分別為56.4%、44.4%、43.6%、52.5%、51.2%,從而表明,在硬骨魚類分化前,CD3γ/δ已與CD3γ、CD3δ、CD3ε基因發(fā)生分離；結(jié)構(gòu)序列進(jìn)一步分析顯示,羅非魚CD3γ/δ具有其他物種CD3的共有特征性基序,即胞外區(qū)的2個(gè)半胱氨酸殘基、CxxCxE基序及胞漿區(qū)的一個(gè)免疫受體活化基序ITAM。 2)羅非魚CD4由9個(gè)外顯子組成,cDNA長(zhǎng)3259 bp,其中5’端UTR 141bp,3’端UTR 1714 bp, ORF 1404 bp,編碼467個(gè)氨基酸,其中包括信號(hào)肽20個(gè)氨基酸、胞外區(qū)394個(gè)氨基酸、跨膜區(qū)23個(gè)氨基酸、胞內(nèi)區(qū)30個(gè)氨基酸；系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,羅非魚CD4與其他物種CD4-like各聚為不同的枝,說明其分化時(shí)間早,與河豚、東方渶、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、斑點(diǎn)叉尾洶(Ictalurus punctatus)、斑馬魚(Danio rerio)等在內(nèi)的硬骨魚類CD4同聚為一枝,其氨基酸序列的相似度分別為45.8%、46%、37.6%、34.5%、29.3%；結(jié)構(gòu)序列進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),羅非魚CD4分子胞外區(qū)具有4個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域,存在多個(gè)保守性位點(diǎn),包括WTC基序和N-糖基化位點(diǎn),其胞漿區(qū)也有一個(gè)保守的CxC基序。 3)羅非魚CD8α由5個(gè)外顯子組成,cDNA長(zhǎng)1050 bp,其中包括5’端UTR 424 bp和ORF部分序列626 bp,編碼208個(gè)氨基酸,其中包括信號(hào)肽21個(gè)氨基酸、胞外區(qū)151個(gè)氨基酸、跨膜區(qū)23個(gè)氨基酸、胞內(nèi)區(qū)13個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,羅非魚CD8α與其他物種CD8β各聚為一枝,說明其分化時(shí)間早,與河豚、大西洋鮭、斑點(diǎn)叉尾洶、斑馬魚、鯉魚(Cyprinus carpio)等在內(nèi)的硬骨魚類CD8α聚為一枝,其氨基酸序列的相似度分別為51.7%、41.8%、34.6%、32.3%、35.9%。結(jié)構(gòu)序列進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在已知物種的CD8分子中,參與V結(jié)構(gòu)域鏈內(nèi)二硫鍵形成的兩個(gè)半胱氨酸基序非常保守,而p56lck結(jié)合基序CxC及與β2m、MHCⅠ類分子相互作用的殘基如精氨酸、賴氨酸和亮氨酸等不保守。 2. RT-PCR檢測(cè)CD3γ/δ、CD4與CD8α在各組織的表達(dá)模式,結(jié)果顯示,CD3γ/δ、CD4與CD8α在多種組織均有表達(dá),但在免疫相關(guān)組織如鰓、脾、腎臟、頭腎、腸中表達(dá)量明顯高于非免疫相關(guān)組織。 3.經(jīng)生物信息學(xué)系統(tǒng)分析,結(jié)合融合蛋白原核表達(dá)策略,分別構(gòu)建了羅非魚T淋巴細(xì)胞表面特異分化抗原CD3γ/δ、CD4與CD8α的胞外區(qū)段及Foxp3非保守區(qū)段的原核表達(dá)載體(包括pColdⅠ和pET-28a),在不同條件下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果顯示： 1) CD3γ/δ-pET-28a型重組質(zhì)粒在不同溫度(20℃、30℃、37℃)下均有目的蛋白的可溶性表達(dá),在37℃條件下表達(dá)量最高； 2) Foxp3-F1R2-pET-28a型重組質(zhì)粒在30℃、37℃有明顯目的蛋白的包涵體表達(dá),兩種溫度條件下其表達(dá)量無明顯差異； 3) CD4-pColdⅠ、CD4-pET-28a、CD8-pET-28a型重組質(zhì)粒在不同溫度下均未檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王衛(wèi)衛(wèi);吳謖琦;孫修勤;樊廷俊;;硬骨魚免疫系統(tǒng)的組成與免疫應(yīng)答機(jī)制研究進(jìn)展[J];海洋科學(xué)進(jìn)展;2010年02期

2 王進(jìn);劉清泉;張野;徐哲;黃長(zhǎng)形;;人FOXP3 cDNA的克隆及在原核細(xì)胞中的表達(dá)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2007年07期

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本文編號(hào)：1577315