發(fā)布時間：2018-03-04 15:25

  本文選題：hESCs　切入點(diǎn)：定型內(nèi)胚層　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 研究結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor,CTGF)在人胚胎干細(xì)胞(Human embryonic stem cells, hESCs)增殖及其向定型內(nèi)胚層(Definitive endoderm, DE)細(xì)胞分化中所發(fā)揮的作用及其調(diào)控機(jī)制。 方法： 首先以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)為飼養(yǎng)層細(xì)胞,在體外條件下培養(yǎng)hESCs,并將hESCs轉(zhuǎn)移至無飼養(yǎng)層體系下繼續(xù)培養(yǎng)。通過免疫熒光和堿性磷酸酶染色的方法對所培養(yǎng)hESCs的Oct4、Nanog及堿性磷酸酶等干性標(biāo)志性基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,從而證明所培養(yǎng)細(xì)胞的分化全能性。在此基礎(chǔ)上,利用ActivinA與Wnt3a的因子組合誘導(dǎo)hESCs向DE細(xì)胞分化,并通過流式細(xì)胞術(shù)對分化的效率進(jìn)行檢測。 在以上的工作基礎(chǔ)上,我們展開了CTGF對人胚胎干細(xì)胞增殖與分化作用的研究。一方面我們通過堿性磷酸酶染色的方法考察CTGF對hESCc增殖的影響；另一方面,通過流式細(xì)胞術(shù)分析CTGF在hESCs向DE細(xì)胞分化中的作用。 為進(jìn)一步研究CTGF在hESCs增殖與分化中的作用機(jī)制,我們通過Western Blot險測了在hESCs中CTGF對MAPK信號通路和TGF-β信號通路中相關(guān)蛋白磷酸化的影響。從而初步確定了在hESCs中與CTGF調(diào)控相關(guān)的信號通路。 接下來結(jié)合我們實(shí)驗(yàn)室前期工作中的miRNA芯片篩選結(jié)果,對在hESCs分化前后差異表達(dá)倍數(shù)比較高、且都以CTGF為共同靶基因的幾個miRNA對CTGF表達(dá)的調(diào)控作用進(jìn)行了研究。通過實(shí)時定量PCR和Western Blot對這幾個miRNA調(diào)控CTGF表達(dá)的效果進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明miR-375對CTGF的調(diào)控作用最為明顯。接下來利用生物信息學(xué)分析軟件TargetScan和PicTar等對CTGF的基因序列進(jìn)行了分析,預(yù)測了miR-375與CTGF之間的結(jié)合位點(diǎn),并進(jìn)一步通過Luciferase對其結(jié)合關(guān)系進(jìn)行了驗(yàn)證。最后通過堿性磷酸酶染色的方法研究了在hESCs中過表達(dá)miR-375對hESCs增殖的影響。 結(jié)果： 免疫熒光染色和堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)的hESCs其Oct4、 Nanog及堿性磷酸酶均高水平表達(dá),說明hESCs具有良好的分化潛能。誘導(dǎo)hESCs向DE細(xì)胞分化后,細(xì)胞中Sox17的表達(dá)水平比較高,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示CXCR4陽性細(xì)胞在50%以上,說明我們成功建立了hESCs向DE細(xì)胞分化的模型。 對CTGF在hESCs增殖及其向DE細(xì)胞分化中所發(fā)揮作用的研究中,Western Blot的結(jié)果顯示在hESCs向DE細(xì)胞分化的過程中CTGF的表達(dá)明顯下調(diào)。此外我們還發(fā)現(xiàn)CTGF對hESCc的增殖具有一定的促進(jìn)作用,對其向DE細(xì)胞的分化具有抑制作用。 在對CTGF調(diào)控相關(guān)的信號通路的研究中發(fā)現(xiàn),在hESCs中CTGF對MAPK信號通路和TGF-β信號通路均具有促進(jìn)作用。 在miRNA對CTGF表達(dá)的調(diào)控作用研究中,我們發(fā)現(xiàn)miR-375對CTGF的調(diào)控效果最為明顯。uciferase的結(jié)果進(jìn)一步表明,miR-375通過與CTGF的3’UTR區(qū)域結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控CTGF表達(dá)的作用。此外我們還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-375可以抑制hESCs的增殖。 結(jié)論： 1、CTGF對于hESCs的增殖具有明顯的促進(jìn)作用,對hESCs向DE細(xì)胞的分化具有抑制作用。 2、在hESCs中CTGF對人胚胎干細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控作用可能與MAPK信號通路和TGF-β信號通路有關(guān)。 3、miR-375通過與CTGF3'UTR區(qū)域結(jié)合而調(diào)控CTGF的表達(dá)。 意義： 在人體內(nèi),由于肝臟細(xì)胞以及胰腺細(xì)胞等功能性細(xì)胞均由內(nèi)胚層細(xì)胞發(fā)育而來,因此誘導(dǎo)hESCs向DE細(xì)胞分化是最終得到成熟、有功能的肝臟及胰腺細(xì)胞的前提,是最終實(shí)現(xiàn)人體組織修復(fù)和器官再生的基礎(chǔ),也是根治重癥肝病和糖尿病的希望所在。因此研究hESCs維持及其向DE細(xì)胞分化的分子機(jī)制具有非常重要的意義。本課題所開展的CTGF在hESCs增殖及其向DE細(xì)胞分化的作用研究,是hESCs維持及分化機(jī)制研究的一部分,對于人們認(rèn)識hESCs向成熟細(xì)胞定向分化的機(jī)制具有重要意義,對于疾病的治療也具有潛在的應(yīng)用價值。
[Abstract]:Objective:
Objective to study the role of Connective tissue growth factor (CTGF) in the proliferation of human embryonic stem cells (Human embryonic stem cells, hESCs) and its role in the differentiation of stereotypic endoderm (Definitive, cells) cells and its regulatory mechanism.
Method錛，

本文編號：1566235