本文選題：hESCs　切入點：定型內胚層　出處：《廣西醫(yī)科大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的： 研究結締組織生長因子(Connective tissue growth factor,CTGF)在人胚胎干細胞(Human embryonic stem cells, hESCs)增殖及其向定型內胚層(Definitive endoderm, DE)細胞分化中所發(fā)揮的作用及其調控機制。 方法： 首先以小鼠胚胎成纖維細胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)為飼養(yǎng)層細胞,在體外條件下培養(yǎng)hESCs,并將hESCs轉移至無飼養(yǎng)層體系下繼續(xù)培養(yǎng)。通過免疫熒光和堿性磷酸酶染色的方法對所培養(yǎng)hESCs的Oct4、Nanog及堿性磷酸酶等干性標志性基因的表達水平進行檢測,從而證明所培養(yǎng)細胞的分化全能性。在此基礎上,利用ActivinA與Wnt3a的因子組合誘導hESCs向DE細胞分化,并通過流式細胞術對分化的效率進行檢測。 在以上的工作基礎上,我們展開了CTGF對人胚胎干細胞增殖與分化作用的研究。一方面我們通過堿性磷酸酶染色的方法考察CTGF對hESCc增殖的影響；另一方面,通過流式細胞術分析CTGF在hESCs向DE細胞分化中的作用。 為進一步研究CTGF在hESCs增殖與分化中的作用機制,我們通過Western Blot險測了在hESCs中CTGF對MAPK信號通路和TGF-β信號通路中相關蛋白磷酸化的影響。從而初步確定了在hESCs中與CTGF調控相關的信號通路。 接下來結合我們實驗室前期工作中的miRNA芯片篩選結果,對在hESCs分化前后差異表達倍數(shù)比較高、且都以CTGF為共同靶基因的幾個miRNA對CTGF表達的調控作用進行了研究。通過實時定量PCR和Western Blot對這幾個miRNA調控CTGF表達的效果進行了檢測,結果表明miR-375對CTGF的調控作用最為明顯。接下來利用生物信息學分析軟件TargetScan和PicTar等對CTGF的基因序列進行了分析,預測了miR-375與CTGF之間的結合位點,并進一步通過Luciferase對其結合關系進行了驗證。最后通過堿性磷酸酶染色的方法研究了在hESCs中過表達miR-375對hESCs增殖的影響。 結果： 免疫熒光染色和堿性磷酸酶染色結果顯示,體外培養(yǎng)的hESCs其Oct4、 Nanog及堿性磷酸酶均高水平表達,說明hESCs具有良好的分化潛能。誘導hESCs向DE細胞分化后,細胞中Sox17的表達水平比較高,流式細胞術結果顯示CXCR4陽性細胞在50%以上,說明我們成功建立了hESCs向DE細胞分化的模型。 對CTGF在hESCs增殖及其向DE細胞分化中所發(fā)揮作用的研究中,Western Blot的結果顯示在hESCs向DE細胞分化的過程中CTGF的表達明顯下調。此外我們還發(fā)現(xiàn)CTGF對hESCc的增殖具有一定的促進作用,對其向DE細胞的分化具有抑制作用。 在對CTGF調控相關的信號通路的研究中發(fā)現(xiàn),在hESCs中CTGF對MAPK信號通路和TGF-β信號通路均具有促進作用。 在miRNA對CTGF表達的調控作用研究中,我們發(fā)現(xiàn)miR-375對CTGF的調控效果最為明顯。uciferase的結果進一步表明,miR-375通過與CTGF的3’UTR區(qū)域結合而發(fā)揮調控CTGF表達的作用。此外我們還發(fā)現(xiàn)過表達miR-375可以抑制hESCs的增殖。 結論： 1、CTGF對于hESCs的增殖具有明顯的促進作用,對hESCs向DE細胞的分化具有抑制作用。 2、在hESCs中CTGF對人胚胎干細胞增殖與分化的調控作用可能與MAPK信號通路和TGF-β信號通路有關。 3、miR-375通過與CTGF3'UTR區(qū)域結合而調控CTGF的表達。 意義： 在人體內,由于肝臟細胞以及胰腺細胞等功能性細胞均由內胚層細胞發(fā)育而來,因此誘導hESCs向DE細胞分化是最終得到成熟、有功能的肝臟及胰腺細胞的前提,是最終實現(xiàn)人體組織修復和器官再生的基礎,也是根治重癥肝病和糖尿病的希望所在。因此研究hESCs維持及其向DE細胞分化的分子機制具有非常重要的意義。本課題所開展的CTGF在hESCs增殖及其向DE細胞分化的作用研究,是hESCs維持及分化機制研究的一部分,對于人們認識hESCs向成熟細胞定向分化的機制具有重要意義,對于疾病的治療也具有潛在的應用價值。
[Abstract]:Objective:
Objective to study the role of Connective tissue growth factor (CTGF) in the proliferation of human embryonic stem cells (Human embryonic stem cells, hESCs) and its role in the differentiation of stereotypic endoderm (Definitive, cells) cells and its regulatory mechanism.
Method錛，

本文編號：1566235